[發(fā)明專利]一種HA阻斷劑的制備方法、抗體檢測(cè)系統(tǒng)

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010077316.6
• 申請(qǐng)日: 2020-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN111393523A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張杰;李永剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇帆博生物制品有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/02
• 分類號(hào): C07K16/02;G01N33/68
• 代理公司: 北京志霖恒遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11435
• 代理人: 趙奕

1.一種HA阻斷劑的制備方法，其特征在于，所述HA阻斷劑的制備方法包括以下步驟：

第一步，將沉淀用原兩倍腹水體積0.01MpH7.4的磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解，用0.01MpH7.4的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行透析；棄去上清，解透析袋，將抗體轉(zhuǎn)移至燒杯，在攪拌狀態(tài)下用量筒倒入原腹水體積的飽和硫酸銨溶液，硫酸銨飽和度為33％；攪拌，混勻分裝入離心杯，配平，離心，棄去上清，得到純化抗體；

第二步，將得到的抗體倒入燒杯中，冰浴；將冰浴放在在磁力攪拌器上，攪拌的同時(shí)加入25％戊二醛至終濃度為0.4mg/ml；

第三步，慢速濾紙過濾，使用紫外分光光度計(jì)OD280nm檢測(cè)抗體濃度，用PBS緩沖液稀釋，加入甘油，再加入Proclin300，保存；

第四步，將HBR稀釋液滴加到待測(cè)試的含有HA樣本的培養(yǎng)基中，每孔中加入HBR稀釋液100uL；在空氣95％、二氧化碳5％，濕度為70％-80％，溫度37攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)時(shí)間為2-3小時(shí)；將樣品、檢測(cè)微球、異嗜性抗體干擾指示微球和標(biāo)記可檢測(cè)信號(hào)的第二抗體混合，形成一反應(yīng)體系；檢測(cè)反應(yīng)體系中第二抗體-抗原-第一抗體-微球四元復(fù)合物中微球上的可檢測(cè)信號(hào)，并與標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，確定反應(yīng)體系中目標(biāo)抗原的存在與否和/或數(shù)量。

2.如權(quán)利要求1所述的HA阻斷劑的制備方法，其特征在于，所述第一步中硫酸銨純化抗體具體包括以下步驟：

步驟一，將冷凍的腹水在無菌環(huán)境下37℃溫浴溶解，用脫脂紗布過濾，量取過濾后的腹水體積，加入等體積0.01MpH7.4的磷酸緩沖鹽溶液，混勻；

步驟二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，溫和攪拌；逐漸滴加硫酸銨溶液至飽和度為50％；攪拌1小時(shí)，10000r/min，4℃離心20分鐘后去除上清，用等體積的硫酸銨重懸沉淀兩次后再次離心，并去除上清；

步驟三，將得到的沉淀用原兩倍腹水體積0.01MpH7.4的磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解，用0.01MpH7.4的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行透析，期間換液三次，換液時(shí)間不少于4小時(shí)；

步驟四，棄去上清，解透析袋，將抗體轉(zhuǎn)移至燒杯，在攪拌狀態(tài)下用量筒勻速倒入原腹水體積的飽和硫酸銨溶液，此時(shí)硫酸銨飽和度為33％；攪拌1小時(shí)，混勻分裝入離心杯，配平，10000r/min，4℃離心20分鐘，棄去上清。

3.如權(quán)利要求2所述的HA阻斷劑的制備方法，其特征在于，所述步驟四之后還需進(jìn)行：將收集到的沉淀用原腹水體積1/2的0.01MpH7.4磷酸緩沖鹽溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行透析，期間換液3次，換液時(shí)間不少于4小時(shí)；收集抗體，觀察是否有沉淀：如有沉淀，用快速濾紙過濾去除沉淀，量取抗體體積；如無沉淀，直接量取抗體體積，輕輕混勻抗體，使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定A280nm的蛋白含量，并記錄測(cè)量用0.01MpH7.4磷酸緩沖鹽溶液稀釋至17mg/ml，使用微量紫外分光光度計(jì)在A280模式測(cè)定抗體濃度，并記錄測(cè)量結(jié)果。

4.如權(quán)利要求1所述的HA阻斷劑的制備方法，其特征在于，所述第二步中戊二醛交聯(lián)具體包括以下步驟：

步驟一，將得到的抗體倒入燒杯中，冰浴1h；將冰浴放在在磁力攪拌器上，保持冰量沒過抗體液面，攪拌的同時(shí)加入25％戊二醛至終濃度為0.4mg/ml，加入時(shí)間為20s；

步驟二，攪拌下加入2M甘氨酸至終濃度為0.01M，攪拌30min；

步驟三，使用0.01MpH7.4磷酸緩沖鹽溶液對(duì)樣品進(jìn)行透析，期間換液二次，換液時(shí)間不少于6小時(shí)；

步驟四，解透析袋，樣品5500r/min，4℃離心18min，取上清，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體濃度，并記錄測(cè)量結(jié)果。

5.如權(quán)利要求1所述的HA阻斷劑的制備方法，其特征在于，所述第三步中慢速濾紙過濾，使用紫外分光光度計(jì)OD280nm檢測(cè)抗體濃度，用PBS緩沖液稀釋，加入甘油，再加入Proclin300，保存具體包括以下步驟：慢速濾紙過濾，使用紫外分光光度計(jì)OD280nm檢測(cè)抗體濃度，用0.01MpH7.4的PBS緩沖液稀釋至10mg/ml，加入總體積2％甘油，再加入總體積0.1％Proclin300，-20℃保存。