[發(fā)明專利]一種檢測(cè)外泌體miRNA的電化學(xué)傳感器及其制備與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010068436.X
• 申請(qǐng)日: 2020-01-20
• 公開（公告）號(hào): CN111175365B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 顏玉蓉;劉萍;申波;李新民;丁世家
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/327
• 分類號(hào): G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 尹麗云

1.一種檢測(cè)外泌體miRNA的電化學(xué)傳感器的制備方法，所述電化學(xué)傳感器包括工作電極、參比電極和對(duì)電極，其特征在于，所述工作電極的制備方法包括以下步驟：

(1)金電極表面處理：將裸金電極表面處理干凈，備用；

(2)制備擴(kuò)增產(chǎn)物：將T型結(jié)構(gòu)復(fù)合物(Ts)、燃燒鏈 F、靶序列T混合，得混合液，孵育，得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述T型結(jié)構(gòu)復(fù)合物(Ts)采用DNA單鏈P、R、L1和L2制備而成，所述DNA單鏈P、R、L1和L2的摩爾比為1:1:1:1，所述單鏈P的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述單鏈R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述單鏈L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述單鏈L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述燃燒鏈F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述靶序列T的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述T型結(jié)構(gòu)復(fù)合物(Ts)末端凸出的胸腺嘧啶核苷數(shù)為2個(gè)；

(3)將捕獲探針固定至處理干凈的金電極表面，再將步驟(2)所得的擴(kuò)增產(chǎn)物滴加到固定有捕獲探針的金電極表面，孵育，制得熵驅(qū)動(dòng)的鏈置換循環(huán)放大體系；所述捕獲探針為巰基修飾的捕獲探針，序列如SEQ ID NO.7所示；

(4)將DNA單鏈1-9混合，退火得到DNA納米片(DNS)，所述單鏈1-9的核苷酸序列如SEQID NO.8-SEQ ID NO.16所示；將亞甲藍(lán)(MB)與DNA納米片(DNS)混合反應(yīng)得到MB-DNS混合物，然后將MB-DNS混合物滴加到步驟(3)所得的金電極表面，孵育，得到DNA納米片納米分子放大檢測(cè)體系，即完成所述工作電極的制備。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中，混合液中靶序列T的終濃度≥65aM；

和/或，步驟(2)中，孵育時(shí)間≥30min。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中，混合液中靶序列T的終濃度為0.1f M-1nM；

和/或，步驟(2)中，孵育時(shí)間為30-90min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中，混合液中靶序列T的終濃度為100pM；

和/或，步驟(2)中，孵育時(shí)間為60min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)中，所述捕獲探針的濃度為100～1000nmol/L；

和/或，步驟(3)中，捕獲探針固定在金電極表面上后，需采用MCH封閉非特異性吸附位點(diǎn)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)中，所述捕獲探針的濃度為1000nmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)和步驟(4)中，孵育反應(yīng)時(shí)間為30-90min；

和/或，步驟(3)和步驟(4)中，孵育溫度為4-48℃；

和/或，步驟(4)中，所述DNA納米片(DNS)的濃度為0.5-1.5μM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(3)和步驟(4)中，孵育反應(yīng)時(shí)間為60min；

和/或，步驟(3)和步驟(4)中，孵育溫度為37℃；

和/或，步驟(4)中，所述DNA納米片(DNS)的濃度為1μM。

9.一種采用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法制備得到的電化學(xué)傳感器。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的電化學(xué)傳感器在檢測(cè)外泌體miRNA上的應(yīng)用。