[發明專利]副溶血性弧菌特異性新分子靶標及其快速檢測方法

有效

• 申請號: 202010068269.9
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111154901B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 吳清平;相欣然;葉青華;張菊梅;龐銳;雷濤;王涓;古其會;韋獻虎;張友雄;曾海燕
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）;廣東環凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;王蘭蘭

本發明公開了副溶血性弧菌特異性新分子靶標及其快速檢測方法，本發明方法提供了用于鑒別副溶血性弧菌的20個新特異性分子檢測靶標，可根據靶標分子設計相應的引物組，并通過對待檢物進行PCR，分析PCR產物的電泳結果即得到是否存在副溶血性弧菌。與現有技術相比，本發明可用于檢測某些生化反應不敏感的菌株，彌補生化鑒定的缺陷，同時本發明提供了副溶血性弧菌更多的特異性分子靶標，彌補常見毒力基因靶標檢測區分度不足的缺陷，更加具有實用性；本發明方法還具有操作簡單、檢測結果特異性好，結果判定簡單的優點，對于食品中的副溶血性弧菌識別具有重要意義。

技術領域

本發明屬于微生物檢驗技術領域，具體涉及副溶血性弧菌特異性新分子靶標及其快速檢測方法。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種常見的食源性致病菌，已是我國引起食物中毒的首要因素。由于副溶血性弧菌嗜鹽的特性，其主要分布在沿海和海洋水域等富鹽的環境中，并附著在鱈魚、沙丁魚、鯖魚、比目魚、章魚、蝦、蟹、蛤蜊、龍蝦、小龍蝦、扇貝和牡蠣等海洋生物的體表生長。人們如果食用了被副溶血性弧菌污染的未煮熟的食物會引起食物中毒，其發病潛伏期一般為1～4天，引起以發熱(約占中毒患者的27％)，惡心(71％)，嘔吐(32％)，腹痛(82％)，腹瀉(98％)等為主要癥狀的急性胃腸炎，嚴重者可發展成敗血癥，如若治療不及時可引起死亡。

隨著物流網絡的日益完善，海產品市場流通愈加頻繁，內陸地區的副溶血性弧菌檢出也逐漸增多，因此該菌在我國乃至全球范圍內呈現擴散趨勢。由于消費者缺乏對海產品源致病菌危害的認識，會在不同程度上忽略食品加工操作的規范，例如生熟食加工和烹飪器皿的混合使用，這造成了不同類型食品的交叉污染。在對我國內陸水產市場中副溶血性弧菌的檢測結果顯示不同食品中該菌的檢出率及致病性呈上升趨勢：水產品中該菌的總污染率為68.78％，其中淡水產品的污染率高達32.78％，平均菌濃度為66.63MPN/g；羅非魚為該菌最常污染的魚類；海產品為36％，海蝦中的檢出率最高。對于非水產品中副溶血性弧菌的檢出率分別為：豬肉4.81％、牛肉2.17％、雞肉6.66％、鴨肉1.21％、禽蛋及其制品5.51％。河鮮、海鮮類產品不再是副溶血性弧菌的唯一攜帶者，食物鏈中越來越多的其他類型食品成為副溶血性弧菌感染人體的新媒介。近年來在我國由副溶血性弧菌引起的食物中毒案例已經超過沙門氏菌，居于由食源性致病菌引起的食源性疾病首位(副溶血弧菌毒力因子及致病機理的研究進展，市售海水產品副溶血性弧菌帶菌狀況調查)，在不同類型食品中廣泛的開展副溶血性弧菌的危害分析和風險評估迫在眉睫。

副溶血性弧菌的檢測主要利用國標規定的傳統培養方法(GB 4789.7-2013)，該方法結果較為準確，檢測時間較長(一周左右)、操作復雜(預增菌、選擇性培養、顯色培養、生化鑒定)、成本高，且靈敏度較低可能會出現漏檢結果。以PCR為主的分子生物學檢測方法以其快速、準確、簡便的特點，逐漸成為取代傳統檢測方法最具潛力的檢測技術之一。

目前，國內外PCR檢測方法對上述副溶血性弧菌檢測的分子檢測靶標及引物已有一定的報道，通常采用副溶血性弧菌常見的特異性毒力基因tdh，tlh，trh，toxR和VP1332基因作為檢測靶標。但是副溶血性弧菌的毒力基因與弧菌弧菌家族的其他物種均表現出不同程度的同源性，并且根據臨床菌種測序結果統計發現不含有毒力基因的副溶血性弧菌依然對人體健康存在危害，因此通過毒力基因靶標還不能較好的實現副溶血性弧菌的精準篩查。根據我們目前已有報道的特異性、靈敏度高的基因靶標中十分少，難以滿足實際檢測的需要，基于原有的副溶血性弧菌分子靶標的精準鑒定面臨了巨大的挑戰；因此尋找新型特異性靶標分子用于副溶血性弧菌快速、精確檢測具有重要意義。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的是克服現有技術的不足，提供用于鑒別副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的特異性新分子靶標及其快速檢測方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：本發明要求保護一組用于鑒別副溶血性弧菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～20所示。