[發(fā)明專利]中華絨螯蟹5-HT2B受體基因及其克隆方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010067121.3
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111378669A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊筱珍;龐楊洋;成永旭
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C07K14/705
• 代理公司: 上海申浩律師事務(wù)所 31280
• 代理人: 張潔

本發(fā)明公開了一種中華絨螯蟹5?HT2B受體基因及其克隆方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)5?HT2B受體的表達(dá)序列標(biāo)簽設(shè)計(jì)引物，通過反轉(zhuǎn)錄獲得3’和5’末端側(cè)翼片段，并與5?HT2B受體的表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行拼接后可獲得中華絨螯蟹5?HT2B基因的全長序列。對于5?HT2B受體基因的研究，將為蟹類行為、腸道生理及5?HT受體功能的研究奠定理論基礎(chǔ)，也將為蟹品質(zhì)、飼料節(jié)約、減少由飼料造成的環(huán)境污染等應(yīng)用方向提供理論支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種中華絨螯蟹5-HT2B受體基因及其克隆方法。

背景技術(shù)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又稱河蟹，是我國重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖蟹類，屬甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要位置。河蟹生性好斗，打斗行為使其種內(nèi)互相殘殺現(xiàn)象極其嚴(yán)重，斷肢和再生時有發(fā)生。打斗會造成斷肢蟹的出現(xiàn)，進(jìn)而影響存活、生長和品質(zhì)，再生會增加養(yǎng)殖成本，減少再生蟹的品質(zhì)。

5-羥色胺(5-HT)在行為學(xué)中的作用已在哺乳和兩棲類動物中已廣泛關(guān)注(MikóZ,2017；Hernández-Plata,2015)，且與腦等中樞神經(jīng)調(diào)控密切相關(guān)。其需要與其受體結(jié)合后才能發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)5-HT在龍蝦的打斗或抑郁行為中有重要作用(Huber,2005；Moore,2007)。本課題組也已發(fā)現(xiàn)其在中華絨螯蟹打斗行為中起著重要的作用(Yang,2018；Pang,2019)，但并不清楚中樞神經(jīng)系統(tǒng)如腦和胸神經(jīng)節(jié)，在5-HT介導(dǎo)的行為學(xué)中的作用如何，而且至今有關(guān)蟹類5-HT多種受體的結(jié)構(gòu)與功能仍不清楚。此外，5-HT能促進(jìn)腸道運(yùn)動，表現(xiàn)為食物在腸道中的存留時間減少。說明5-HT參與了食物在腸道中的運(yùn)動。腸道動力直接與投喂頻率及量相關(guān)，結(jié)合生理水平的基礎(chǔ)研究，進(jìn)行科學(xué)投喂勢必減少飼料浪費(fèi)及由飼料造成的環(huán)境污染。也已證明，5-HT2B受體是GPCR家族中的重要一員，參與體內(nèi)的多種生理和病理活動。大量的研究表明，5-HT2B受體的選擇性拮抗劑，在人類醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要的作用，對肺動脈高血壓、偏頭痛、腸易激綜合癥和肝纖維化等相關(guān)疾病的治療方面有潛在的臨床應(yīng)用價值。在蟹類的養(yǎng)殖中肝胰腺是其營養(yǎng)、生殖和發(fā)育調(diào)節(jié)的重要器官，也是疾病損傷最主要的器官之一。因此，本發(fā)明對于5-HT2B受體結(jié)構(gòu)的研究，是對其功能研究的基礎(chǔ)，對于此基因的研究，將為蟹類行為、腸道生理及5-HT受體功能的研究奠定理論基礎(chǔ)，也將為蟹品質(zhì)、飼料節(jié)約、減少由飼料造成的環(huán)境污染等應(yīng)用方向提供理論支持。

本發(fā)明存在以下難點(diǎn)：(1)由于蟹沒有基因組的參考序列，也沒有基因組表達(dá)序列，對于此物種的相應(yīng)受體克隆難度高；(2)對于相近物種也存在基因組差異性大，多態(tài)性高的問題；(3)該基因的表達(dá)量較低；(4)該基因的GC含量高，GC含量60％。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術(shù)難題，本發(fā)明提供一種克隆方法，以獲得中華絨螯蟹5-HT2B的受體基因，內(nèi)容如下：

一種中華絨螯蟹5-HT2B受體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1中華絨螯蟹5-HT2B基因核酸序列(serotonin 2b receptor)

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