[發明專利]一種提取強酸性條件下基質微生物總RNA和總蛋白的方法

在審

• 申請號: 202010064013.0
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111254139A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 李侃;任鑫坤;張徐祥;王慶;任洪強
• 申請（專利權）人: 南京大學;南京大學宜興環保研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07K1/14;C12N1/06
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務所 32346
• 代理人: 陳彬;蔣海軍

本發明公開了一種提取強酸性條件下基質微生物總RNA和總蛋白的方法，屬于分子生物學技術領域。本發明的方法包括以下步驟：1)取基質材料，采用pH＝3.6～5.5的緩沖溶液A在一定壓力的水壓下沖洗基質材料，將微生物從附著基質表面上洗脫，離心收集菌體；2)將步驟1)收集的菌體裂解，采用溶液B提取總RNA和總蛋白，所述溶液B為pH＝4.0～4.5的Trizol試劑。所述水壓壓力范圍為30～120MPa。本發明提取方法顯著改善了強酸性條件下基質附著微生物總RNA和總蛋白的提取效率和質量，滿足同時提取或分別提取RNA和蛋白質的檢測要求。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及分別或同時提取強酸性條件下基質微生物總RNA和總蛋白的方法。

背景技術

核糖核酸(RNA)是以DNA雙鏈中的一條為模板轉錄，形成的一條單鏈生物大分子，主要功能是實現基因(DNA)中的遺傳信息到蛋白質的表達，即遺傳信息向表型轉化的橋梁。對RNA的測定相較于DNA的測定，主要用于衡量生物體某一基因，或整個基因組在某一時間、環境下的表達水平。近年來，針對某一環境中微生物應對特定環境壓力、污染物暴露或其他刺激因素對微生物群落生態功能的影響，基于新型分子生物學技術的各類RNA檢測技術獲得了長足的發展，實時熒光定量核酸擴增檢測qPCR法、RNA芯片，乃至對總RNA進行測序的宏轉錄組技術得到了廣泛地應用。

和RNA相比，蛋白質是更為直接的實現生命活動的有機大分子，同時也是構成細胞基本骨架的有機物之一。因此，蛋白質是生命的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命，它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。機體中的每一個細胞的幾乎所有重要組成部分，以及細胞的所有重要生命過程都有蛋白質參與。近年來，針對某一環境中微生物應對特定環境壓力、污染物暴露或其他刺激因素對微生物群落生態功能的影響，基于新型分子生物學技術的各類蛋白質檢測技術也獲得了長足的發展，蛋白質印跡法(WesternBlot)、酶聯免疫吸附法(ELISA)，乃至基于質譜和數學分析的對總蛋白進行測定的宏蛋白組學技術得到了深入的發展和廣泛的應用。

RNA和蛋白質檢測的主要挑戰之一是RNA或蛋白質的提取和純化，由于RNA和蛋白質在生物體內不斷合成和分解，以應對環境因素的改變，因此RNA或蛋白質的提取對取樣時間點的把控要求嚴格。并且由于環境中(如人手和空氣中)廣泛存在RNA酶，在提取過程中極易引入體系中，因此RNA的提取需要格外小心，需要控制提取時樣品的環境溫度，縮短提取時間，提高提取效率，以避免RNA的降解。對于蛋白質而言，由于蛋白酶廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中，因此對于蛋白質的提取需要避免蛋白酶的作用。

對于強酸性環境(pH3)中的微生物樣品總RNA或總蛋白的提取純化，還存在極端環境會為微生物帶來嚴重的生存壓力，微生物菌體一旦破裂，強酸性會導致RNA在極短的時間內降解為短鏈的小片段，或是引發蛋白質變性或水解為小片段，或自溶液中沉淀出去的問題。為了適應復雜生境，微生物自身會產生特殊的聚合酶，組成生物膜、菌團等共同抵抗復雜生境下的生存壓力。但環境中存在的各種抑制物(氫離子、腐植酸、酚類化合物和重金屬離子等)在低pH值條件下會影響微生物的酶活性，并導致核糖核酸分子的不穩定，直接引發蛋白質的變性和RNA的水解，環境樣品中廣泛存在的腐植酸類物質，由于其大分子的結構與核糖核酸或蛋白質部分類似，因此腐植酸類物質會與這兩種生物大分子緊密結合，從而導致被共提取，引入雜質，進一步加大了下游實驗的難度。

目前很多研究者采取了不同的方法預處理微生物樣品，使其滿足總RNA或總蛋白提取的需要。這些方法主要可分為兩類，一種是在微生物生長的原始位置，通過依次添加不同的試劑，對總RNA進行提取的原位提取法。