[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010060055.7
• 申請(qǐng)日: 2020-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111253491B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林長(zhǎng)青;陳天圣;郝昆;黃鶴;高琦;李艷召;許智慧;郄霜;趙廣珍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京堯景基因技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K17/10
• 分類(lèi)號(hào): C07K17/10;C07K17/08;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京悅和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11714
• 代理人: 司麗春

本發(fā)明涉及一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素?磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物，所述凝集素?磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物包括：磁性載體；和偶聯(lián)在磁性載體外側(cè)的凝集素。本發(fā)明提供的凝集素?磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物可以快速、精準(zhǔn)、自動(dòng)化分離臨床樣本中的糖基化外泌體，分離效率高，分離后的外泌體形態(tài)完整，無(wú)破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌體液體檢測(cè)，或直接進(jìn)行免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)，或直接提取外泌體內(nèi)相關(guān)核酸進(jìn)行核苷酸序列檢測(cè)分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及生物分離相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物、及分離方法。

背景技術(shù)

外泌體是細(xì)胞多泡內(nèi)體與質(zhì)膜融合時(shí)釋放產(chǎn)生的具有生物活性的微小囊泡，其直徑約為30～150nm，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)之一；在人健康的生理情況下，外泌體可以在細(xì)胞之間運(yùn)送DNA、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等多種生物活性物質(zhì)，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)等多種過(guò)程，完成細(xì)胞間物質(zhì)及信息的傳遞。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞均會(huì)分泌外泌體，并且在血液、唾液、尿液、腦脊液、積液和乳汁等體液中都能夠提取到外泌體。

外泌體與腫瘤、慢性感染性疾病、自身免疫病等很多疾病相關(guān)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí)，細(xì)胞分泌的外泌體的成分、含量、性質(zhì)等都可能發(fā)生改變；糖基化外泌體在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均有著重要作用，外泌體的檢測(cè)研究能有效監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展；由于外泌體在臨床樣本中含量比較低，外泌體的分離富集對(duì)外泌體的研究至關(guān)重要。

目前，外泌體分離方法很多，主要有：超速離心法或梯度密度離心法，免疫磁珠法等。其中：超速離心法或梯度密度離心法是基于外泌體與其他生物組份密度的微小差異進(jìn)行分離，該方法需要特殊設(shè)備，樣品需求量比較大，耗時(shí)長(zhǎng)，且因?yàn)椴煌R床樣本的特點(diǎn)不同，采用該方法的分離效果穩(wěn)定性差，進(jìn)一步地超速離心還容易造成囊泡損傷從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；免疫磁珠法的原理是外泌體表面的特異性蛋白如：CD9/CD63/CD81等與包被有對(duì)應(yīng)抗體的免疫磁珠相結(jié)合，進(jìn)行磁分離，但由于免疫磁珠體積較小，粒徑為納米級(jí)別且小于等于外泌體的直徑，因此免疫磁珠與外泌體結(jié)合的空間位阻較大，外泌體結(jié)合不充分，分離效率不高。此外，免疫磁珠法中應(yīng)用的洗脫液為酸性洗脫液，容易造成外泌體囊泡破裂、形態(tài)不完整，因此，也就無(wú)法準(zhǔn)確分離出糖基化外泌體，并將其應(yīng)用于疾病的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程中檢測(cè)、監(jiān)控及診斷。

因此，一種能快速、精準(zhǔn)、自動(dòng)化高效分離富集臨床樣本中的糖基化外泌體的組合物及方法的研究建立是必須的。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物，本發(fā)明還提供了一種含有該凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物的糖基化外泌體分離組合物，以及使用該凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行糖基化外泌體分離的方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供的凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物可以精準(zhǔn)分離臨床樣本中的糖基化外泌體，分離效率高，分離后的外泌體形態(tài)完整，無(wú)破裂或碎裂，可直接用于糖基化外泌體液體檢測(cè)，或直接進(jìn)行免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)，或直接提取外泌體內(nèi)相關(guān)核酸進(jìn)行基因檢測(cè)分析。本發(fā)明提供的糖基化外泌體分離的方法中，利用外泌體外表面豐富的糖鏈可以和凝集素結(jié)合的原理，采用有效地清洗及有效地洗脫方法可以分離糖基化外泌體，并且非常簡(jiǎn)便、快速、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，重復(fù)性好，分離后的外泌體形態(tài)完整，無(wú)破裂或碎裂，將其應(yīng)用于疾病的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程中檢測(cè)、監(jiān)控及診斷。

本發(fā)明提供了一種用于分離臨床樣本中的糖基化外泌體的凝集素-磁性載體偶聯(lián)復(fù)合物，包括：磁性載體；和偶聯(lián)在磁性載體外側(cè)的凝集素；其中：

所述凝集素包括：木菠蘿凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素(VVA和/或VVL)、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麥胚素、大豆凝集素、蕓豆凝集素、蝸牛凝集素(HAA和/或HPA)中的任意一種或者兩種及以上；

所述磁性載體包括：葡聚糖磁珠、瓊脂糖磁珠、樹(shù)脂或環(huán)氧樹(shù)脂磁珠、聚苯乙烯磁珠中的任意一種或者兩種及以上。