[發明專利]一種基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法

在審

• 申請號: 202010056549.8
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111249471A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 陳智毅;劉付春;余金穗;李悅;王奕;張輝;屠佳偉
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第三醫院（廣州重癥孕產婦救治中心;廣州柔濟醫院）
• 主分類號: A61K47/59
• 分類號: A61K47/59;A61K48/00;A61K49/22;A61P35/00
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

包括如下步驟：

(1)制備生物素化脂質微泡；

(2)制備親和素化脂質微泡；

(3)制備生物素化PEG-SS-PEI納米粒；

(4)制備聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物PSP@MB。

2.根據權利要求1所述的基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

所述步驟(1)的操作過程是將成膜材料溶于氯仿中，水浴，蒸發溶劑形成脂膜，水浴，真空抽氣，充入C₃F₈，振蕩，離心，得到分層的生物素化脂質微泡；

成膜材料是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、生物素-磷脂-聚乙二醇2000(Biotin-DSPE-PEG2000)；或者是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、生物素-磷脂-聚乙二醇2000(Biotin-DSPE-PEG2000)、三甲基銨丙烷(DPTAP)。

3.根據權利要求2所述的聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物及其制備方法，其特征在于：

所述步驟(1)的詳細操作過程是：將成膜材料溶于1ml氯仿中，用超聲波清洗儀分散溶解5min后，再分裝在4個Vial瓶，打開瓶蓋，60℃水浴2小時后，置于旋轉蒸發儀24h后形成脂膜；取其中1個Vial瓶中加800μl含甘油PBS緩沖液，旋轉蒸發含甘油PBS緩沖液；超聲波分散5min分散脂膜，60-65℃水浴15min使脂膜完全溶解，用真空泵抽氣3min，后充入C₃F₈，于銀汞調和器振蕩45s，獲得分層白色泡沫狀液體，即是生物素化脂質微泡，其余3個Vial瓶蓋好瓶蓋，-20℃冰箱保存。

成膜材料及其用量比例是：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)10mg、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)4mg、生物素-磷脂-聚乙二醇2000(Biotin-DSPE-PEG2000)2mg；或者是：二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)9mg、生物素-磷脂-聚乙二醇2000(Biotin-DSPE-PEG2000)2mg、三甲基銨丙烷(DPTAP)1mg。

4.根據權利要求1所述的基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

所述步驟(2)的操作過程是：將生物素化脂質微泡與鏈霉親和素按比例混合，振蕩使充分連接，離心，取下層液體，去除未連接的鏈霉親和素，獲得親和素化脂質微泡。

5.根據權利要求4所述的基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

所述步驟(2)的詳細操作過程是：將生物素化脂質微泡與鏈霉親和素按質量比2:1比例在vial瓶混合，輕柔振蕩30min使其充分連接，離心(2000rcf,5min)，使用1ml胰島素針抽取下層液體，去除未連接的鏈霉親和素，獲得親和素化脂質微泡。

6.根據權利要求1所述的基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

所述步驟(3)的操作過程是：將PEI溶液，加入Biotin-PEG-SS-NHS溶液50ml(10mg/ml),室溫攪拌，過夜反應，獲得生物素化PEG-SS-PEI納米粒。

7.根據權利要求6所述的基因遞送的聚乙烯亞胺納米粒微泡復合物的制備方法，其特征在于：

所述步驟(3)的詳細操作過程是：將50ml濃度為1mg/ml的25kDa PEI溶液，加入濃度為10mg/ml Biotin-PEG-SS-NHS溶液50ml,室溫攪拌，過夜反應；獲得生物素化PEG-SS-PEI納米粒，使用截留分子量3500的透析袋在雙蒸水中透析3天，使用0.22μm濾頭過濾生物素化PEG-SS-PEI納米粒除菌，將生物素化PEG-SS-PEI納米粒濃度調整至1mg/mL，4℃冰箱保存。