[發(fā)明專利]生物胺誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111187750B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊向東;丁素玲;朱小偉
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02;A61P9/10
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 于曉菁

本發(fā)明提供了一種用生物胺促進(jìn)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和成熟的方法與應(yīng)用。本發(fā)明在固定的時間點(diǎn)向多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體外培養(yǎng)物中加入組胺，誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和成熟。并提供了檢測組胺促進(jìn)ips分化成心肌細(xì)胞的時間和濃度的方法。本方法成熟，操作簡單，環(huán)境友好；此方法獲得的細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的特征性細(xì)胞表面標(biāo)志和形態(tài)標(biāo)志，能夠自發(fā)性地周期性收縮，適用于心臟病的研究、藥物篩選和細(xì)胞治療等多種應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及獲得人心肌前體細(xì)胞和成熟心肌細(xì)胞系的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，誘導(dǎo)心肌分化的方法主要有兩種，一種是誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cells，iPSCs)單層細(xì)胞培養(yǎng)法，即iPSCs在鋪有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，通過添加某些小分子化合物來調(diào)控心肌分化關(guān)鍵信號通路，以獲得跳動的心肌細(xì)胞。另一種是形成類似胚胎結(jié)構(gòu)的含有多種類型細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，即擬胚體法(EBs),EBs法誘導(dǎo)心肌分化過程是iPSCs純化后經(jīng)過數(shù)天的懸浮培養(yǎng)以誘導(dǎo)EBs形成，隨后轉(zhuǎn)移到明膠包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。EBs中細(xì)胞種類多，包括內(nèi)、中、外三個胚層的細(xì)胞。目前從技術(shù)上可以使iPSCs分化為搏動心肌細(xì)胞，EBs方法模擬體內(nèi)心肌分化的過程，更符合體內(nèi)心肌分化的過程，但這種方法獲得心肌細(xì)胞的分化效率和細(xì)胞純度較低。iPSCs單層細(xì)胞培養(yǎng)法通過程序性調(diào)控Wnt,BMP等信號通路，在分化時間上更具有可操控性，可以具體到分化的各個主要階段。隨著研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)的方式得到改良和優(yōu)化，如聯(lián)合使用激活素A(activin A)、骨形態(tài)生成蛋白4(BMP4)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)或血管細(xì)胞生長因子(VEGF)等多種藥物或生長因子可一定程度提高iPSCs源心肌的誘導(dǎo)分化效率，此外通過共培養(yǎng)的技術(shù)也能實(shí)現(xiàn)分化效率的一定提高。但總體來說，單層細(xì)胞方法分化培養(yǎng)時間長，培養(yǎng)基(生長因子)價格昂貴，一定程度地限制了多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化技術(shù)的應(yīng)用。

目前研究認(rèn)為，iPSCs來源的心肌細(xì)胞類似于胎兒或胚胎期CMs,結(jié)構(gòu)及功能上具有不成熟性，是制約其基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的重要原因之一。大量的研究致力于探索促進(jìn)分化心肌成熟的方法，例如通過延長體外培養(yǎng)的時間，機(jī)械和電刺激培養(yǎng)，添加化學(xué)因子等，但都有各自比較嚴(yán)重的缺陷。如體外延長培養(yǎng)時間不僅耗時耗力，而且細(xì)胞容易污染；給與機(jī)械和電刺激模擬在體心肌的微環(huán)境，具有一定的可行性，但效率不高；研究模擬體內(nèi)心肌的生長環(huán)境給予不同的基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)心肌的成熟及心肌線粒體的穩(wěn)態(tài)，但這些基質(zhì)價格貴且操作不夠便捷。通過添加某些關(guān)鍵的化學(xué)因子促進(jìn)心肌成熟，不僅簡單易操作，而且可以通過高通量篩選具有明顯促成熟的一些化學(xué)因子，特別是天然存在的，生物體內(nèi)源性的一些小分子物質(zhì)，更加符合心肌自然分化與成熟的過程。目前有研究報導(dǎo)維甲酸能顯著促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化，激素類如甲狀腺素和G-CSF等可以促進(jìn)分化心肌成熟。

組胺(histamine)是由組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase HDC)催化組氨酸(histidine)脫羧生成的小分子生物胺。組胺通過作用于細(xì)胞表面的組胺受體，激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號通路進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與生物體病理生理過程。除了在免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)信號傳遞，胃酸分泌和免疫細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮重要作用。本專利申請人前期研究中首先發(fā)現(xiàn)HDC在CD11b+不成熟髓系細(xì)胞高表達(dá)，而且內(nèi)源性組胺缺失能夠促進(jìn)炎癥相關(guān)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，首先提出“內(nèi)源性組胺是一種抑瘤因子”的科學(xué)假說。近期研究又發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性組胺缺乏HDC基因敲除小鼠心梗后心臟功能損害加重，早期外源性補(bǔ)充適當(dāng)濃度的組胺能有效保護(hù)心肌損傷和心室重構(gòu)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)組胺受體H1R和H2R信號參與了組胺在調(diào)控免疫細(xì)胞功能和保護(hù)缺血性心血管疾病的作用。組胺參與造血細(xì)胞生成和神經(jīng)細(xì)胞分化等過程，但組胺在心肌干細(xì)胞分化及心臟發(fā)育中的作用及機(jī)制，目前還沒有相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可豐富和改善現(xiàn)有的多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化成熟的方法，以達(dá)到縮短獲得心肌細(xì)胞所需時間，提高獲得的心肌細(xì)胞成熟度，增強(qiáng)移植的心肌細(xì)胞抗低氧、炎癥損傷的能力，并可顯著降低獲得較大數(shù)量心肌細(xì)胞的成本的方法。