[發明專利]生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法與應用

有效

• 申請號: 202010055527.X
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111187750B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 楊向東;丁素玲;朱小偉
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02;A61P9/10
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 于曉菁

1.生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于，在固定的時間點向多能干細胞向心肌細胞誘導分化的體外培養物中加入組胺，誘導多功能干細胞向心肌細胞分化和成熟；所述組胺的濃度范圍為10^-7~10^-5M；所述的加入組胺的時間點為分化的第3-5天。

2.如權利要求1所述的生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于其中的組胺為二鹽酸組胺。

3.如權利要求1所述的生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于其中的組胺的濃度為10^-5M。

4.如權利要求1所述的生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于檢測其中的組胺促進 ips分化成心肌細胞的時間和濃度的方法為：

a)在包被matigel膠的培養皿加入適量mTESR培養基，按1/1000比例加入Y試劑，即Y27632 s1049 selleck, ROCK inhibitor10uM，將消化好或復蘇好的ips細胞加入其中，輕輕混勻，鏡下觀察，放入37℃細胞培養箱內；

b)2小時后去掉培養液，加入不含Y試劑的mTESR培養基即可;

c)每4天傳代一次，具體根據細胞狀態；細胞密度達到80-90%時開始分化；去除培養皿內的培養基，D-PBS洗一遍；加入8umol/L CHIR的RPMI1640 +B27 minus insulin的培養基，分化48小時；

d)去除培養基，加入新鮮B27minusinsulin培養基24小時；去掉培養液，加入新的含5umol/L IWR-1抑制劑的RPMI1640 +B27 minus insulin培養基；分化48小時，之后換RPMI1640 +B27 minus insulin培養基兩天，期間不用換液；7天后，分化好之后，換RPMI1640+B27with insulin 的培養基；以后每3天換一次液體；

e)按上述方法分別在分化開始的不同天數的培養基中分別加入不同濃度組胺；

f)分析心肌細胞跳動面積、頻率、心肌細胞標志物a-MHC和cTNT表達量，檢測不同濃度的組胺對ips向心肌分化的促進效應。

5.如權利要求4所述生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于：步驟e中的分化開始的不同天數為分化開始至第七天、分化開始至第三天、分化第三天至第五天、或分化第五天至第七天。

6.如權利要求4所述生物胺誘導多功能干細胞向心肌細胞分化的方法，其特征在于：步驟e中的不同濃度組胺為10^-4M、10^-5M、或10^-6M。