[發明專利]一種可以有效降低錯誤的UMI設計方法

有效

• 申請號: 202010043604.X
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN110853709B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 段小紅;樊玉才;楊春燕;張騰龍;張碩;周啟明
• 申請（專利權）人: 求臻醫學科技（北京）有限公司
• 主分類號: G16B30/10
• 分類號: G16B30/10;G16B20/50;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種可以有效降低錯誤的UMI設計方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟S1、篩選132組UMI序列；步驟S2、UMI分子在NGS文庫分子中的結構位置設計；步驟S3、回復校正。本發明公開的可以有效降低錯誤的UMI設計方法可以通過識別錯誤UMI的序列信息進行回復校正，提升UMI的錯誤識別效率，降低PCR或者測序過程中的錯誤，提高測序的準確率。

技術領域

本發明涉及基因測序技術領域，尤其涉及一種可以有效降低錯誤的UMI設計方法。

背景技術

下一代測序技術（Next Generation Sequencing, NGS）在分子腫瘤學領域有廣泛的應用，其中最常用的是基因組DNA變異分析和RNA表達分析。這些分析應用除了能對整個基因組和外顯子組進行檢測，還可專門測序特定的區域。

在NGS測序前，常用兩種方法富集目標區域：可以使用靶向特異性探針從文庫分子中雜交捕獲，也可利用目標區域特異性引物對文庫進行擴增。由于以上兩種常用的目標富集方法在文庫制備，靶向序列捕獲，以及測序過程中均涉及聚合酶鏈式反應（PolymeraseChain Reaction, PCR），且測序存在一定錯誤的概率，這些因素會導致高深度測序過程中放大假陽性的信號。在使用NGS檢測稀有突變時，檢測人員需要高深度的測序，因此能夠減少或避免系統誤差，正確區分低頻突變和測序產生的背景噪音顯得尤為重要。

唯一標識序列（UMI）是為每一個樣本的原始DNA分子上連接一段獨一無二的序列編碼。UMI通常為完全隨機的核苷酸序列，或簡并核苷酸序列。具有相同UMI測序讀出的序列是相同原始分子經PCR復制的產物。UMI可以追蹤重復產物，將PCR假陽性的突變位點與原始分子中真正的變異區分開來，通過在靶向捕獲檢測中添加傳統UMI分子，對標記后的單個DNA分子進行高深度測序，進一步提高單個分子單堿基的準確性。

在對測序數據分析時，通過UMI將帶有相同標記的分子聚集在一起進行統一分析。由于測序背景噪音在高深度測序數據中呈零散分布，統計一致性序列后即得到了校正后的精確序列。

因此，尋求一種可以有效降低錯誤的 UMI設計方法是業內研究者們亟待解決的難題。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種可以有效降低錯誤的 UMI設計方法，該方法可以通過識別錯誤UMI的序列信息進行回復校正，提升UMI的錯誤識別效率，降低PCR或者測序過程中的錯誤，提高測序的準確率。

為達到以上目的，本發明采用的技術方案為一種可以有效降低錯誤的 UMI設計方法，其特征在于，包括如下步驟。

步驟S1、篩選132組UMI序列：7個核苷酸為一組UMI，由于每個位點可選擇4種核苷酸（A/T/C/G）中的任意一種，雙端UMI的組合為268435456種。

步驟S2、UMI分子在NGS文庫分子中的結構位置設計：UMI分子采用標簽連接到目標序列兩端的策略，連接在P5端測序接頭或P7端測序接頭兩端的隨機UMI分子。

步驟S3、回復校正：通過對單個堿基發生錯誤的UMI分子信息進行生物信息比對，對UMI分子進行回復校正，并在分析前剔除無法校正的錯誤UMI分子，找出其正確的UMI序列，并進一步用于后續的測序分析；進一步地，使用FASTQ軟件對原始下機數據進行處理，去掉測序質量較低的數據，隨后使用UMI的生物信息學分析工具fgbio將質控過的數據依據UMI進行分類操作。

進一步地，所述步驟S1中UMI篩選原則為：首先列出所有長度為7的隨機序列；對所有產生的隨機序列中包含連續2個堿基和3個堿基序列進行篩選過濾；剩余隨機序列中去除GC含量超過5個的隨機序列；篩選得到的隨機序列選擇其中一條作為基準序列，例如“ACACACA”，與其他序列進行比對，保留差異性大于3個堿基的序列；選擇下一條篩選得到的隨機序列作為基準序列進行比對，直到所有序列均作為基準序列進行比對，最終篩選出132條序列。