[發(fā)明專利]霍亂弧菌O1群的核酸快速恒溫檢測(cè)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010036105.8
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN111020008B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李雪玲;劉偉;李園園;賈犇;韋朝春;陸長(zhǎng)德;李亦學(xué);曹永梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院;上海旺旺食品集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發(fā)明公開了一種針對(duì)霍亂弧菌O1群的快速恒溫檢測(cè)方法、引物組及試劑盒。所述方法為：從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增霍亂弧菌O1群特異性序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測(cè)樣品中是否存在霍亂弧菌O1群。本發(fā)明檢測(cè)方法具有高靈敏度和高特異性，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，操作便捷，成本低，具廣泛應(yīng)用前景。

本申請(qǐng)是2016年8月30日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?01610780456.3、發(fā)明名稱為：“快速恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法、引物及試劑盒”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)；該母案申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2015年9月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?01510556917.4、發(fā)明名稱為“快速恒溫檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測(cè)霍亂弧菌O1群的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)廣泛分布于海洋與淡水環(huán)境中，是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢驗(yàn)檢疫對(duì)象和食源性致病菌。根據(jù)菌體(O)抗原的不同，霍亂弧菌可分為許多血清群，但僅發(fā)現(xiàn)O1和O139群能引發(fā)霍亂。其中O1群霍亂弧菌自1817年以來，在全球共引發(fā)七次霍亂大流行。因此，霍亂弧菌O1群的早期檢測(cè)和診斷對(duì)治療和預(yù)防霍亂的發(fā)生和蔓延十分重要。

傳統(tǒng)霍亂弧菌檢測(cè)方法由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)于食源性致病菌檢測(cè)過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究人員陸續(xù)開發(fā)出了PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)手段，但是這兩種方法都需要專門的檢測(cè)儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測(cè)部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進(jìn)行的實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。為了確保食品安全，急需快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)食品中的霍亂弧菌O1群。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻(xiàn)Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測(cè)生物的公認(rèn)的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計(jì)的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說，用戶首先必須確保該靶基因?yàn)榇郎y(cè)物種的特異序列。以發(fā)明專利ZL201010584749.7和ZL201310119610.9為例，它們分別針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的霍亂弧菌的特異基因——ctxA基因和dnaA基因，采用LAMP技術(shù)進(jìn)行霍亂弧菌檢測(cè)。然而，所謂“公認(rèn)的特異性基因”往往基于滯后的知識(shí)，并未基于不斷增長(zhǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實(shí)際應(yīng)用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的通用性不能確保的問題。也就是說，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的霍亂弧菌O1群檢測(cè)序列實(shí)際上并非霍亂弧菌O1群所共有，即，有可能漏檢霍亂弧菌O1群的部分菌株。類似的問題也存在于特異性的確認(rèn)，即，有可能將非霍亂弧菌O1群錯(cuò)誤地認(rèn)定為霍亂弧菌O1群。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的霍亂弧菌O1群檢測(cè)方法，同時(shí)滿足基層檢測(cè)部門對(duì)快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部開展實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容