[發(fā)明專利]一種苦豆子SaENO2基因的克隆及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010034192.3
• 申請日: 2020-01-13
• 公開（公告）號: CN111154789B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設計）人: 王慶鈺;朱有成;閆帆;王豆豆;王英;劉雅婧;李景文;郭文云;楊旭光;張鑫生;趙磊;高子為;蒙佳慧;劉宇淇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201
• 代理人: 邵銘康;朱世林

一種苦豆子SaENO2基因的克隆及應用屬基因工程技術領域，本發(fā)明從苦豆子酵母表達文庫中通過模擬逆境脅迫篩選出與抗鹽堿相關的苦豆子基因，通過生物信息學分析確定其為苦豆子烯醇化酶2基因SaENO2，利用RT?PCR技術進行定量檢測發(fā)現該基因在苦豆子的根、莖、葉片中均有表達，其中在莖中表達量最高，且在堿處理條件下，莖中表達量明顯提高。將該基因通過構建酵母表達載體和植物表達載體并成功轉化酵母BY4743和擬南芥中進行功能驗證，結果表明該基因在酵母和擬南芥中過表達后能夠明顯提高其耐鹽堿性和耐旱性，這為通過基因工程技術提高作物的抗逆性提供了新的資源。

技術領域

本發(fā)明屬基因工程技術領域，具體涉及一種苦豆子烯醇化酶2基因的獲取、構建含有編碼基因的重組載體在酵母菌BY4743中進行耐逆性功能驗證、構建植物過表達重組載體在擬南芥中進行耐逆性功能驗證、同時利用實時熒光定量PCR（實時PCR，Real-Time-PCR，）的方法來研究該基因在非生物脅迫NaCl、NaHCO₃和PEG處理條件下的功能。

背景技術

植物在自然界中不斷受到多重壓力的挑戰(zhàn)。在各種逆境壓力中，鹽堿脅迫是嚴重制約植物生長發(fā)育的非生物脅迫之一，也是制約農作物生產和生態(tài)環(huán)境建設的因素之一。目前，隨著土壤鹽堿化的加劇以及耕地面積的日益減少，這對于農作物的產量和質量具有嚴重的影響。鹽堿度極大地限制了半干旱和干旱地區(qū)的作物產量。世界上有8.31億?公頃的土壤受到過高鹽堿度的影響。其中，堿土（堿性）為4.34億公頃?，鹽堿土為3.97億公頃。土壤鹽分主要歸因于NaCl的積累，而堿土則主要歸因于NaHCO₃和Na₂CO₃的積累。預計到2050年，50%以上的耕地會發(fā)生鹽堿化，嚴重威脅著土地利用率和作物產量。中國鹽堿地尤其是內陸鹽堿地多是鹽化和堿化混合，成分復雜且程度各異。鹽化和堿化常常同時發(fā)生，這種現象在很多地區(qū)普遍存在。

隨著科學技術的進步，鹽堿地在技術改良方面已經取得了很多成果。但是，受地域、資源、成本等限制，鹽堿地的改良工作尚不完善。因而，培育耐鹽堿品種的植物，提高植物的耐鹽堿能力是緩解鹽堿地對植物影響的一個有效生物措施，同時還可以產生較好的生態(tài)和經濟效益，促進農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，關于植物適應鹽堿逆境的研究已成為國內外專家學者們當前研究中的一個熱點

苦豆子(?Sophora?alopecuroides.?L)?為豆科槐屬植物，別名、苦豆草、苦甘草等，為多年生草本、根莖地下芽旱生耐鹽植物。其耐旱、耐鹽堿性顯著，是一個抗性基因豐富的基因資源庫。因此，從苦豆子中篩選克隆鹽脅迫相關基因，分析其耐鹽性，闡明其相關功能，有助于對抗鹽基因的進一步利用。

烯醇化酶2（Enolase2,簡稱ENO2）是雙功能酶，除了作為糖酵解酶，參與糖的分解代謝外，還具有轉錄因子的功能。烯醇化酶(?Enolase,?ENO,?2-phospho-D-glyceratehydrolyase)又稱為2-磷酸-D-甘油酸鹽水解酶，能夠催化2-磷酸-D-甘油酸?(2-PGA)?向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)?的轉化，是糖酵解途徑中唯一的脫水步驟，又可在糖質異生過程中催化逆向反應，即可作為磷酸丙酮酸鹽水合酶催化PEP向PGA的轉化過程。烯醇化酶不僅在生物體內普遍存在，而且還是許多生物體中表達最為豐富的細胞質蛋白之一。

植物?ENO?也包含三種同工酶，分別是?ENO1、ENO2?及?ENO3，其氨基酸序列是高度保守的，都包含一個典型的烯醇化酶?N?端區(qū)域和一個高度保守的?DNA?結合區(qū)域。植物ENO2?與動物的?α-ENO?同源性最高，而在植物中，擬南芥和水稻中的ENO2?同源性較高。ENO2?是在細胞質中發(fā)揮主要功能作用的烯醇化酶，在植物生長發(fā)育過程中高表達，其表達量是?ENO1?和?ENO3?的十倍左右。

在擬南芥，水稻等植物中，已觀察到烯醇化酶在轉錄、轉錄后和翻譯后水平上應答高鹽、低溫、缺氧等非生物脅迫，推測烯醇化酶可能在植物非生物脅迫應答中發(fā)揮重要作用。