[發明專利]重組真菌漆酶的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202010028902.1
• 申請日: 2020-01-12
• 公開（公告）號: CN111154781B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 潘程遠;黃芊芊;朱蘭蘭
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/81;C02F3/34;C02F101/38;C02F101/32;C02F101/30
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種真菌漆酶基因Lac1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。本發明還公開了漆酶重組菌株的構建方法：將真菌漆酶基因Lac1與表達載體pPIC9K連接，所得的重組質粒pPIC9K?Lac1經線性化后，轉化畢赤酵母GS115，構建獲得畢赤酵母重組菌株GS115/pPIC9K?Lac1；將畢赤酵母重組菌株進行誘導發酵，篩選具漆酶活性畢赤酵母重組菌株作為漆酶重組菌株。本發明還同時提供了利用漆酶重組菌株制備重組漆酶的方法；重組漆酶用于染料脫色。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組真菌漆酶及其基因、制備方法和在染料脫色中的應用。

背景技術

漆酶是一種具有多酚氧化酶活性的銅藍氧化酶，它可將底物氧化成自由態，并通過電子傳遞將空氣中的氧氣變化成水。漆酶普遍存在于真菌、高等植物、細菌中，在昆蟲、海綿和地衣中也存在類似漆酶活性的多酚氧化酶。漆酶的底物非常廣泛，不僅可以直接氧化酚類物質，也可以借助介體，如2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和1-羥基苯并三唑(HBT)，氧化非酚類物質。所以，漆酶在工業染料脫色、環境污染物生物修復、生物檢測、化合物合成等方面具有很好的應用潛力。

真菌漆酶是目前分布最廣泛、來源最多的一類漆酶。尤其是在白腐真菌中，它們往往能分泌兩種及以上的漆酶同工酶。基因組分析表明，栓菌屬Trametes的白腐真菌具有5-7個漆酶基因，密孔菌屬Pycnoporus真菌具有4-5個漆酶基因，這些漆酶基因一般不同時進行表達翻譯，即使有些漆酶基因進行了翻譯，但它們的理化屬性也存在一定的差異。雖然人們對真菌漆酶進行了大量的、深入的研究工作，但是由于產量低、催化能力弱、不耐極端條件等原因，使得真菌漆酶很少進行商業化應用。

利用漆酶基因的異源表達獲得重組漆酶，是提高漆酶產量、改善理化屬性、滿足漆酶商業化開發的重要途徑。漆酶基因異源表達主要分為兩類系統。一是原核表達系統，它主要是以大腸桿菌為表達體系，目前研究較多是利用芽孢桿菌Bacillus為漆酶基因供體。二是真核表達系統，它主要以畢赤酵母、釀酒酵母、絲狀真菌為表達體系，以各種栓菌屬、密孔菌屬、側耳屬Pleurotus和鬼傘屬Coprinus漆酶基因為供體。異源表達能提高重組漆酶的產量，如云芝栓孔菌Trametes versicolor漆酶基因LccC在畢赤酵母中表達后的漆酶產量達到34.23U/mL。異源表達也能改變漆酶對催化環境pH的適應，如克勞氏芽孢桿菌Bacillusclausii漆酶基因Cot A在大腸桿菌中表達后，重組漆酶的最適pH值為9.0。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種重組真菌漆酶的制備方法及其應用；從而克服目前大多數真菌漆酶對金屬、有機溶劑或高溫等極端條件無耐受性、限制了其工業化使用的缺陷。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種真菌漆酶基因Lac1，該真菌漆酶基因Lac1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

說明：該真菌漆酶基因來自毛栓孔菌MX2。

本發明還同時提供了上述真菌漆酶基因Lac1編碼的蛋白質，該蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

本發明還同時提供了真菌漆酶基因的克隆方法：

提取毛栓孔菌MX2總RNA，并反轉錄成cDNA；以毛栓孔菌MX2反轉錄得到的cDNA為模板，設計擴增引物Lac1F和Lac1R，擴增得到一個不具信號肽序列的漆酶基因Lac1，該基因的開發閱讀框大小為1500bp(為SEQ ID NO：1)；

Lac1F：CGGAATTCGCCATTGGACCGAAGGCGAACCTCG(內含EcoR I酶切位點)；

Lac1R:ATTTGCGGCCGCTCACAGATCGCCCTCCGCCAGCTTG(內含Not I酶切位點)。

本發明還同時提供了漆酶重組菌株的構建方法，包括以下步驟：