[發(fā)明專利]一種重組EBV gHgL免疫原的制備方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010026943.7
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN111154803B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段良偉;王輝;鄭前前;牛玉娜;牛志國;張佳璐;劉夢楠
• 申請（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C07K14/03;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組EBV gHgL免疫原的制備方法及其應用。本發(fā)明利用聚合酶鏈式反應PCR技術(shù)，獲得gH和gL的基因片段，將這兩個目的片段分別克隆入昆蟲表達載體pMT，經(jīng)質(zhì)粒大提去除內(nèi)毒素后，與抗性篩選質(zhì)粒pCoBlast一起共轉(zhuǎn)染黑腹果蠅Schneider2細胞，用殺稻瘟菌素進行陽性克隆篩選，篩選出高效分泌表達gHgL的S2穩(wěn)定細胞系。擴大培養(yǎng)后，經(jīng)鎳柱親和層析和凝膠過濾層析兩步純化，即可獲得高均一、高產(chǎn)量、高天然保真性的gHgL。通過微量熱涌動技術(shù)驗證了gHgL與受體EphA2的相互作用，適合作為免疫原用于EBV亞單位疫苗以及與gB和gp350聯(lián)合疫苗的研發(fā)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組EBV gHgL免疫原的制備方法及其應用。

背景技術(shù)

愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，簡稱EB病毒，屬于γ皰疹病毒亞科，可感染世界上95％左右的人口，是最早被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的病毒。它與多種人類疾病特別是惡性腫瘤相關(guān)，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌等。據(jù)估計，全世界每年新增約20萬例EBV相關(guān)癌癥病人，大約14萬病人因它而死亡。因此，安全有效的疫苗亟需用來阻斷EBV的感染。鑒于EBV終身感染的特性和其高致癌性，減毒活疫苗等可能存在著安全問題，疫苗研發(fā)嘗試仍主要集中在亞單位疫苗上面，這樣就對免疫原的大量制備提出了很高的要求。

EBV在人體內(nèi)主要感染B淋巴細胞和上皮細胞，其侵入靶細胞以起始新的感染循環(huán)的過程非常復雜，需要多個病毒包膜糖蛋白以及靶細胞表面受體蛋白的參與。EBV對B淋巴細胞的感染起始于病毒包膜糖蛋白gp350與細胞表面受體CR1/CD35或CR2/CD21的結(jié)合，緊接著糖蛋白gp42與細胞表面受體分子MHC-II結(jié)合，導致與gp42結(jié)合的病毒糖蛋白gHgL復合物以一種未知的方式激活病毒融合蛋白gB，激活的gB可以直接介導病毒和細胞的膜融合，使得病毒可將遺傳物質(zhì)釋放到細胞中，從而完成病毒的進入以起始新的病毒生活周期。EBV對上皮細胞的侵入則起始于包膜糖蛋白BMRF2對細胞表面整合素β1、α5、α3和αv的吸附，隨后病毒糖蛋白gHgL通過與整合素αvβ5，αvβ6或αvβ8，以及最近新發(fā)現(xiàn)的EphA2受體直接相互作用，觸發(fā)gB介導的病毒和細胞膜融合，進而完成病毒的入侵過程。像其它所有皰疹病毒家族成員一樣，gHgL和gB組成了入侵所有靶細胞的核心病毒融合機器，而gp350和BMRF2則是EBV特有的用于入侵不同靶細胞的糖蛋白，并且僅僅是利于病毒對特定靶細胞的有效入侵，本身不是嚴格必需的，對其它的靶細胞也不起作用。。

糖蛋白gp350是EBV表面豐度最高的糖蛋白。最初的研究表明，血清中可阻止B淋巴細胞感染的中和抗體大部分都靶向gp350，因而之前針對EBV疫苗的研發(fā)努力主要集中于重組的gp350。但是，盡管經(jīng)過幾十年的努力，基于gp350的疫苗研發(fā)策略并不能阻止EBV對B淋巴細胞的感染，甚至有文章報道其引出的抗體反而可以增強病毒對上皮細胞的感染。最新的研究結(jié)果表明，血清陽性的患者體內(nèi)，靶向gp350、gHgL和gp42的抗體分別貢獻了44.6％±4.37％、46.9％±3.29％和10.9％±1.85％的B淋巴細胞中和效率,而靶向gHgL的抗體則貢獻了76.0％±0.89％的上皮細胞中和效率。鑒于此，再結(jié)合gHgL在病毒入所有侵靶細胞中過程中的不可或缺的作用，使得gHgL正成為目前最有希望的EBV候選疫苗組分。

EBV gH蛋白屬于I型跨膜蛋白，包含706個氨基酸殘基，可分為四個區(qū)域：信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾巴。gH蛋白功能的發(fā)揮依賴于gL蛋白，gL蛋白是一個沒有跨膜區(qū)，只有137個氨基酸殘基的糖蛋白，其N端23個氨基酸為信號肽。EBV gH和gL蛋白通常形成異二聚體(gHgL)復合物來執(zhí)行功能，在gL蛋白缺失的情況下，單獨表達gH蛋白會導致其大部分滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而且此時的gH蛋白不能正確折疊、糖基化、轉(zhuǎn)運并最終定位在靶細胞膜上。gL這種分子伴侶的性質(zhì)決定了二者只能在一起共表達，無疑給二者的表達增添很多難度。目前已建立的gHgL表達系統(tǒng)均存在者產(chǎn)量不高的問題。

發(fā)明內(nèi)容