[發(fā)明專利]殼聚糖酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010024623.8
• 申請日: 2020-01-10
• 公開（公告）號: CN110819611B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 關(guān)菲菲;田健;伍寧豐;劉曉青;初曉宇;韓焱碩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 北京思元知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發(fā)明公開了殼聚糖酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。針對殼聚糖酶CHIS1754存在催化效率和熱穩(wěn)定性不高，將其應(yīng)用于殼寡糖的酶法生產(chǎn)會導(dǎo)致生產(chǎn)效率不高的問題，為了提高殼聚糖酶CHIS1754的催化效率和熱穩(wěn)定性，本發(fā)明將殼聚糖酶CHIS1754進了多位點突變得到殼聚糖酶突變體，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No.2所示。試驗證實，通過多位點突變得到的殼聚糖酶突變體的催化效率和熱穩(wěn)定性有顯著提高。本發(fā)明進一步將所述的殼聚糖酶突變體應(yīng)用于殼寡糖的酶法生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及殼聚糖酶突變體，進一步涉及該殼聚糖酶突變體在酶法生產(chǎn)殼寡糖中的應(yīng)用，屬于殼聚糖酶突變體及其應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

殼聚糖是一種具有獨特功能特性的天然陽離子聚合物，是由自然界中廣泛存在的甲殼素經(jīng)過脫乙酰作用得到的，主要由Ｄ-氨基葡萄糖通過β-１，４-糖苷鍵連接而成。大量研究表明殼聚糖在食品、化工、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。其中，殼聚糖最為重要的用途是生產(chǎn)殼寡糖。殼寡糖又名殼聚寡糖或幾丁寡糖，作為殼聚糖的下一級產(chǎn)物，具有殼聚糖無法比擬的特性，它具有較高的溶解度和較低的分子量，更容易被生物體吸收，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，低分子量殼寡糖 （如五糖、六糖）還具有抗腫瘤、抗菌、免疫激活及保濕吸濕等特性。

殼聚糖酶水解產(chǎn)生的殼寡糖分子量更易控制且條件溫和，殼聚糖酶水解獲得的殼寡糖分子量一般低于１０ｋＤａ，且更易溶于水，優(yōu)于天然的殼寡糖。殼寡糖比殼聚糖有更好的生物功能，例如在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)θ梭w的 免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、改善肝臟和心肺功能等。此外，殼寡糖在食品行業(yè)還具有重要的應(yīng)用價值，有助于改善腸道，從而促進人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)；可用于生產(chǎn)調(diào)味品，代替市場上一些如苯甲酸鈉等化學(xué)添加劑；可用于生產(chǎn)飲料，具有減肥、美容養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)免疫功能等作用，可用于蔬菜、水果的保鮮，且具有抗菌防腐的功效。

制備殼寡糖的方法主要有化學(xué)降解法、物理降解法和酶降解法等。化學(xué)降解法產(chǎn)生的衍生物較多，低聚糖得率低且環(huán)境污染嚴重；物理降解法生產(chǎn)成本較高，難以實現(xiàn)工業(yè)化；酶法因條件溫和、選擇性高，對環(huán)境污染 小，產(chǎn)物安全性好，受到了越來越多的重視與關(guān)注。如今，酶法水解殼聚糖制備殼寡糖已成為甲殼素領(lǐng)域的一個研究熱點。

殼聚糖酶(chitosanase)是一種能分解殼聚糖的專一性酶，它是由Monaghan于1973年在研究細 菌和真菌過程中首先提出來的，并于1992年在國際酶學(xué)命名會議上被系統(tǒng)命名。殼聚糖酶不同于幾丁質(zhì)酶，它能夠降解完全脫乙酰化的殼聚糖，生成殼寡糖（Monaghan R L, Eveleigh D E, Tewari F P, et al. Chitosanase, a novel enzyme[J]. Nature New Biol, 1973, 245(142):78-80.）。殼聚糖酶在細菌、真菌和 病毒等類群的微生物中均有存在，但大多數(shù)微生物產(chǎn)殼聚糖酶存在活性較低，催化效率和熱穩(wěn)定性等問題，從而影響殼寡糖的酶法生產(chǎn)的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種催化效率和熱穩(wěn)定性得到顯著改善的殼聚糖酶突變體；

本發(fā)明的目的之二是將所述的殼聚糖酶突變體應(yīng)用于殼寡糖的酶法生產(chǎn)；

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：