[發(fā)明專利]一種鼻粘膜類器官培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010019555.6
• 申請(qǐng)日: 2020-01-08
• 公開（公告）號(hào): CN111117946B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李剛;汪珂;王顯文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 佛山市神機(jī)營(yíng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44765
• 代理人: 許尤慶

1.一種鼻粘膜類器官培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基的成分及其含量如下：不含Vit-A的B27，1X；N-acetylcysteine，1mM；EGF，50ng/ml；Noggin，100ng/ml；R-spondin 1，250ng/ml；Wnt3a，250ng/ml；A83-01，500nM；Nicotinamide，10mM；Y-27632，10μM；Glutamax，1X；Gastrin，5nM；SB202190，10μM；青霉素鏈霉素混合液，1X；wnt7a，10ng/ml；IL-6，50ng/ml；HEPES，1mM。

2.一種鼻粘膜類器官培養(yǎng)方法，其特征在于，將鼻粘膜組織預(yù)處理得到細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀加入至含有混合膠原溶液的transwell小室內(nèi)皿中，凝固成凝膠；在transwell小室外皿中加入權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)；

所述混合膠原溶液由如下組分配制而成：A.鼠尾I型膠原蛋白，B.1X濃縮無(wú)菌培養(yǎng)基DMEM，C.Advanced DMEM/F12，D.1mol/L無(wú)菌NaOH溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，培養(yǎng)組織來(lái)源包括鼻甲、鼻中隔、鼻底、嗅區(qū)、鼻竇、鼻咽部，預(yù)處理步驟包括洗滌、切碎、消化、裂解步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，預(yù)處理步驟具體為：鼻粘膜組織采用含2％雙抗的Hanks液洗滌后，將組織切碎；加入消化酶I消化，離心棄上清，再加入消化酶II消化，離心棄上清，Hanks液吹打重懸消化的組織沉淀，過濾得到含有鼻粘膜單細(xì)胞的濾液，離心棄上清，加紅細(xì)胞裂解液裂解，離心棄上清得細(xì)胞沉淀；消化酶I包括collagenasetypeIII、透明質(zhì)酸酶、Insulin和EGF；消化酶II包括TrypLE Express和DNaseI酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，混合膠原溶液的配制方法如下：先將100μlB與1mlC混合，再加入875μlA，最后加入15μlD，得到混合膠原溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括更換培養(yǎng)基步驟：每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，更換的培養(yǎng)基同權(quán)利要求1的培養(yǎng)基。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，更換的培養(yǎng)基為條件培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括傳代步驟：將內(nèi)皿中含有細(xì)胞的混合膠原轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加入100Unit/ml膠原酶IV在37℃下解離15-20分鐘，每30天對(duì)類器官進(jìn)行1:2傳代。