[發明專利]抗白粉病的葡萄鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9及其應用

有效

• 申請號: 202010017656.X
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111118042B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 文穎強;胡洋;程遠;余雪娜
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/82;A01H5/12;A01H6/88
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理有限公司 11587
• 代理人: 楊巍;柴春玲

本發明專利申請公開了分離的抗白粉病的葡萄鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9及其應用。本申請涉及基因工程領域，尤其是涉及葡萄抗病育種領域。通過基因克隆技術從抗病的中國野生華東葡萄白河?35?1植株基因組分離獲得了鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9，并將該基因轉入到白粉病易感葡萄植株中獲得了抗白粉病的轉基因葡萄植株，提高了葡萄的抗白粉病能力。

技術領域

本發明專利申請屬于植物抗逆基因鑒定及基因工程技術領域，尤其是抗白粉病的葡萄鈣依賴蛋白激酶基因的分離和鑒定，更具體地涉及從中國野生華東葡萄白河-35-1分離的抗白粉病的鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9及其抗白粉病的應用。

背景技術

白粉病是嚴重危害葡萄生產的重要真菌病害，常導致嚴重減產甚至絕收，造成巨大經濟損失。為防控該病，生產上每年需要噴灑農藥20-30次，嚴重影響葡萄產品的食用安全，威脅人體健康，污染生態環境(Gadoury等人，2012)。目前，葡萄育種者越來越強烈地認識到，盡快挖掘利用野生葡萄的抗病基因，積極開展葡萄精準抗病分子育種，是從根本上解決這一問題的重要途徑。

鈣離子是真核生物細胞中重要的第二信使。鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)是植物中一類特殊的鈣信號解碼蛋白，可獨立完成鈣信號的解碼和傳遞。當植物細胞遭受脅迫時，細胞膜上的受體蛋白識別脅迫信號后會迅速激活鈣離子通道，質外體空間的鈣離子大量內流導致細胞質中鈣離子濃度升高。CDPKs羧基端的EF-hand結構域結合鈣離子后促使CDPKs發生構象改變，暴露其激酶活性中心，此時，CDPKs可以與底物蛋白相互作用并將其磷酸化，對下游底物蛋白的活性或穩定性進行調控。上述過程將鈣信號(細胞質鈣離子濃度振蕩)轉化為磷酸化事件，實現了脅迫信號的傳遞與處理，因此，CDPKs蛋白在植物生長發育與逆境脅迫響應過程中發揮重要調控作用(Sheen，1996)。

鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)以基因家族形式存在于葡萄基因組中。然而，到目前為止，關于葡萄鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)的研究很少，更沒有關于具有抗白粉病功能的葡萄鈣依賴蛋白激酶的報道和研究。這可能是因為抗白粉病的葡萄品種資源匱乏，大多數葡萄品種都是易感白粉病的。例如，葡萄基因組首次測序所采用的歐亞種葡萄品種黑比諾葡萄(PinotNoir)以嬌貴而聞名，它為許多世界佳釀(如羅曼尼·康帝)葡萄酒所采用。然而包括該葡萄在內的大多數歐亞種葡萄品種均易遭受白粉病等病害的侵害(Amrine等人，2015；Gao等人，2016；Yin等人，2017)。

野生華東葡萄(Vitis pseudoreticulata)是我國特有的葡萄野生種。西北農林科技大學野生葡萄種質資源圃中保存的華東葡萄株系白河-35-1對葡萄白粉病、霜霉病等主要葡萄病害表現出較高抗性，但其具體的遺傳學基礎(抗病基因)目前并不清楚(Gao等人，2016；Yin等人，2017)。本文以白粉病易感品種黑比諾葡萄(參考基因組)的鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9為參考，設計特異引物，采用基因克隆技術從華東葡萄株系白河-35-1基因組cDNA文庫中克隆獲得了分離的抗白粉病的鈣依賴蛋白激酶基因，其為葡萄抗白粉病精準分子育種提供基因資源和分子標記，這具有重要理論價值和實踐意義。

發明內容

本發明專利申請從中國野生華東葡萄白河-35-1分離獲得了的鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)基因VpCDPK9，并證明其具有抗白粉病的功能，本申請還涉及VpCDPK9用于葡萄抗白粉病的用途。

在一個實施方案中，本申請的分離的抗白粉病的葡萄鈣依賴蛋白激酶(CDPKs)基因VpCDPK9具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

本發明專利申請的一個方面涉及分離的抗白粉病的葡萄鈣依賴蛋白激酶，其由本申請所述的分離的抗白粉病的鈣依賴蛋白激酶基因VpCDPK9編碼，所述鈣依賴蛋白激酶具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。