[發(fā)明專利]模擬血漿cfDNA及制備方法和測序文庫的構(gòu)建方法

在審

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• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111088303A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛瑞芳;王量;閆慧慧
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州瑞普基因科技有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 張立

本發(fā)明涉及一種模擬血漿cfDNA及制備方法和測序文庫的構(gòu)建方法。該模擬血漿cfDNA的制備方法包括：提供培養(yǎng)細(xì)胞，利用消化液對所述細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，分離獲得含有基因組DNA的樣本；利用亞特蘭提斯雙鏈DNA酶對所述含有基因組DNA的樣本進(jìn)行酶切處理，以便獲得所述模擬血漿cfDNA。通過該方法獲得的模擬血漿cfDNA具有和天然血漿cfDNA相似的片段大小、分布和序列復(fù)雜度，而且制備方法簡單，不需要片段化儀器，節(jié)約儀器成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種模擬血漿cfDNA及制備方法和測序文庫的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)，2018年世界范圍新發(fā)癌癥病例為1810萬，新增死亡病例960萬，癌癥已成為人類的第一殺手。伴隨癌癥的發(fā)病率和死亡率的增長，科技創(chuàng)新和基因檢測水平的發(fā)展，癌癥的分子篩查、基因輔助治療也日益成為當(dāng)代科學(xué)家和各個科研機(jī)構(gòu)的研究熱點(diǎn)和精準(zhǔn)用藥的重要輔助手段。

液體活檢技術(shù)正日益成為實(shí)驗(yàn)室檢測癌癥分子的主要手段，相較于組織活檢經(jīng)常存在的樣本不足，取樣異質(zhì)性等問題，血漿ctDNA的液體活檢具有的取樣便利性和非入侵性等優(yōu)勢，也越來越受到癌癥患者和醫(yī)學(xué)研究者的青睞。但是血漿ctDNA液體活檢也存在一些技術(shù)上的挑戰(zhàn)，最重要的是需要建立一套完整的實(shí)驗(yàn)體系和生信分析，并經(jīng)過嚴(yán)格的性能驗(yàn)證，從而能保證更低頻率的突變信息被穩(wěn)定、可重復(fù)的檢出。這也需要一種可以穩(wěn)定制備、長期保存、性能穩(wěn)定、突變覆蓋率高的模擬血漿cfDNA。

如何獲得性能穩(wěn)定的、與天然cfDNA性能接近的模擬血漿cfDNA，還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種具模擬血漿cfDNA及制備方法和測序文庫的構(gòu)建方法。

模擬人血漿cfDNA質(zhì)量主要取決于以下三個特性：一是DNA大小和分布，血漿DNA的非常重要的一個屬性就是平均大小為170bp，模擬血漿必須具備和天然血漿相似的大小和分布；二是穩(wěn)定性和功能，常用的模擬血漿cfDNA的方法是使用癌癥細(xì)胞系的基因組DNA，直接將其稀釋到正常人血漿DNA中，或者經(jīng)過超聲打斷后再稀釋到正常人血漿中，這種方法得到的模擬cfDNA往往DNA分布范圍較天然cfDNA廣，這樣導(dǎo)致許多DNA無法進(jìn)行后續(xù)的連接擴(kuò)增，不能被整合到建庫中，天然cfDNA壽命較短，由于血漿中存在的蛋白和其它分子，簡單混合DNA和血漿無法得到穩(wěn)定的混合物，DNA降解的很快，無法用于長期的、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)性能檢測，模擬血漿DNA需要具備可以長期穩(wěn)定制備、保存，具有接近天然cfDNA連接性能、擴(kuò)增性能等；三是突變覆蓋率，臨床上對液體活檢檢出的突變類型和突變點(diǎn)數(shù)量越來越多，實(shí)驗(yàn)室必須有具有檢測最廣范圍的突變位點(diǎn)和突變類型的能力和信心，因此也需要構(gòu)建包含更多的突變位點(diǎn)的樣本用于性能驗(yàn)證。

目前制備模擬cfDNA產(chǎn)品的方法主要有機(jī)械打斷、人工合成質(zhì)粒和非特異性酶切打斷等方法。機(jī)械打斷是目前使用的較多的一種模擬cfDNA的方法，其是通過機(jī)械振動和超聲打斷制備獲得，實(shí)驗(yàn)原理為采用機(jī)械振動或聲波震動方式破碎較完整的基因組DNA，使其片段化，和人體中通過相關(guān)酶作用形成cfDNA的方式截然不同。其缺點(diǎn)是機(jī)械打斷形成的DNA片段末端與天然cfDNA片段差異大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中存在檢測下限低、背景噪音高、假陽性率高、不利于自動化等缺點(diǎn)。人工合成質(zhì)粒：其缺點(diǎn)是序列復(fù)雜度遠(yuǎn)低于天然cfDNA，無法模擬天然cfDNA的核酸特點(diǎn)。而采用非特異性酶切打斷，通過利用非特異性的核酸內(nèi)切酶處理gDNA，產(chǎn)生類似cfDNA的片段化DNA，其缺點(diǎn)是多數(shù)核酸酶對堿基位點(diǎn)存在偏好性，DNA片段化程度取決于樣本質(zhì)量，模擬得到的血漿cfDNA與天然的血漿cfDNA偏差較大。

本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)：一種新型的模擬cfDNA酶制劑，可以用來特異的切割雙鏈DNA分子的磷酸二酯鍵來產(chǎn)生帶有5’磷酸基團(tuán)和3’羥基末端的短鏈DNA，而且沒有AU或AT富集區(qū)的切割的偏好性。由此可以制備具有高復(fù)雜度、高靈敏性的近似天然血漿cfDNA。