[發明專利]一種銀杉及其制品實時熒光PCR檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202010017137.3
• 申請日: 2020-01-08
• 公開（公告）號: CN111041121A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 孫濤;孔德英;滕少娜;任風鳴;陸麗華;何玲;李應國;謝鑫
• 申請（專利權）人: 重慶海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務所 50215
• 代理人: 王海軍

本發明公開了一種用于銀杉實時熒光PCR檢測的引物、探針及檢測方法。本發明針對銀杉ITS2基因序列設計并篩選出一組特異性引物和探針，及對應的試劑盒，用于銀杉的實時熒光PCR方法特異性檢測鑒定。以本發明所設計的引物探針采用實時熒光PCR方法檢測，具有良好的特異性、靈敏度，能快速、方便、高效的進行銀杉種質、苗木、材質和遺傳物質的鑒定，對于銀杉物種資源保護、打擊非法盜采、走私等有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，主要針對銀杉(C.argyrophylla)ITS2基因序列設計并篩選出的一組特異引物和探針及，開發的一種銀杉及其制品實時熒光PCR檢測試劑盒、使用方法及應用。

背景技術

銀杉，松科(Pinaceae)銀杉屬(Cathaya)，是第三紀孑遺的珍稀樹種，于19世紀50年代在我國廣西龍勝縣花坪和重慶市南川區金佛山首次發現，屬中國特產的稀有樹種，被譽為植物界的大熊貓、活化石。早在1992年和1999年銀杉就被列為一級國家珍貴樹種和一級國家重點保護野生植物。目前，銀杉僅在中國亞熱帶山地的局部地區有零星殘存，天然銀杉林只在重慶、廣西、貴州和湖南4省市發現有分布。

作為古老的殘遺植物，銀杉的花粉曾在歐亞大陸第三紀沉積物中發現，其形態特殊，胚胎發育與松屬植物相似，對研究松科植物的系統發育、古植物區系、古地理及第四紀冰期氣候等，均有較重要的科研價值。自我國首次發現以來，已引起國內外學界的濃厚興趣和廣泛關注，已對銀杉的生物學特性、生態學習性、繁殖特性以及瀕危原因等方面開展一系列的研究。但其苛刻的生存條件以及低下的繁殖效率，令其仍面臨較大的滅絕及物種資源流失的風險。

生物物種資源是人類生存、國家生態安全和社會可持續發展的戰略性資源，是生物多樣性最基本的組成部分，是維持人類生存、維護國家生態安全的物質基礎，生物物種資源的擁有和開發利用程度已成為衡量一個國家綜合國力和可持續發展能力的重要指標之一。我國是世界上生物物種資源最豐富的國家之一，也是發達國家攫取生物遺傳資源的重要地區。過去我國大量的物種及其遺傳資源被國外研究人員和商業機構搜集無償引出，其中一些重要資源在國外經生物技術改造或加工后，形成其專利技術或專利產品，造成國家利益的重大損失。出入境物種資源查驗已成為物種資源保護的重要手段，然而高效查驗手段的缺失是物種查驗過程中面臨的又一大難題。因此，為保護我國特有的銀杉資源，防止資源流失，有必要建立準確快速的銀杉鑒定技術。

實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術是新發展起來的一項物種特異性檢測鑒定技術，其利用一組特異性的引物探針，通過檢測熒光強度變化來進行檢測，靈敏度高、特異性強，可從基因組層面對物種進行準確鑒定，而且在數小時內即可完成檢測，提高了工作效率。通過實時熒光PCR方法鑒定銀杉，特異性強，結果準確，具有良好的應用前景和推廣價值。

發明內容

本發明目的在于提供用于銀杉實時熒光PCR檢測的引物探針序列及其檢測方法。

一種用于銀杉及其制品實時熒光PCR檢測的引物和探針，包括一對引物，所述引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO.1的正向引物和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的反向引物，所述探針的苷酸序列為SEQ ID NO.3。

利用上述引物和探針進行銀杉實時熒光PCR檢測的檢測方法，包括以下步驟：

1)制備待檢模板DNA：用SDS法、CTAB法或磁珠法提取樣品中的DNA，獲得模板DNA。

2)PCR反應體系：

10μL 2×熒光PCR反應預混液(選用市售產品)，0.4μL 10μmol/L的核苷酸序列為SEQ ID NO.1的正向引物，0.4μL 10μmol/L的核苷酸序列為SEQ ID NO.2的反向引物，0.5μL10μmol/L的核苷酸序列為SEQ ID NO.3的TaqMan探針，2μL待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照或空白對照，滅菌去離子水6.7μL。