[發明專利]一種用于EBV檢測的探針及檢測方法

在審

• 申請號: 202010014973.6
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111074002A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 潘石玄偉;錢剛;蔡霖霖;李振;郎秋蕾
• 申請（專利權）人: 杭州聯川生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6874;C12N15/11
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本發明公開了一種用于EBV檢測的探針及檢測方法。所述探針制備過程需要進行兩輪PCR反應。所述基于NGS技術的檢測方法包括：制備DNA模板，片段化基因組DNA，純化片段化產物，引進組文庫構建，PCR擴增基因組文庫，探針與基因組文庫雜交，磁珠捕獲雜交產物，對得到的捕獲產物進行高通量測序并分析待測樣本中EBV的感染情況。本發明公開的探針、方法具有成本低，數據分析快捷，覆蓋深度高，檢測準確度高等優勢，適合對EBV引起的疾病進行早期篩查和術后診斷，為個性化用藥提供指導。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體涉及一種用于EBV檢測的探針及檢測方法。

背景技術

人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr virus，EBV)，又稱為EB病毒，是最常見能引起人類疾病的病毒之一，為雙鏈線性DNA，基因組長度約為172kb，其形態與其他皰疹病毒相似，圓形、直徑180nm，基本結構含核樣物、衣殼和囊膜三部分。能導致宿主染色體異位、重排，通過LMP1、miRNA影響細胞增殖、遷移、凋亡等重要信號通路，通過LMP2實現免疫逃逸。EBV被認為和許多疾病如侵入型乳腺癌、胃癌、鼻咽癌、結直腸癌、惡性血液腫瘤等有關，在非洲，EBV與伯奇氏淋巴瘤有關聯性，全世界有超過90％的人口受到EBV感染。EBV的傳染途徑主要是經由唾液傳染，常發生在未開發國家或發展中國家，家庭擁擠的幼兒身上，在歐美國家中，常發生于青少年，經由接吻而傳染。EBV能導致宿主染色體異位、重排，通過LMP1、miRNA影響細胞增殖、遷移、凋亡等重要信號通路，通過LMP2實現免疫逃逸。嚴重威脅人類健康，因而一直備受關注。

EB病毒的常規檢測方法有：1.病毒分離：外周血單個核細胞培養分離病毒是檢測皰疹病毒的金標準。以往是抽提患者外周血單個核細胞。與新鮮的正常外周血淋巴細胞或臍帶血淋巴細胞在普昂也中混合培養，但一般需要5-21天。有學者用培養板代替培養小瓶，更便于獲取細胞飛片；將其固定在玻片上進行免疫組化監測，可明顯減少試劑用量，不但降低成本，而且縮短病毒檢出時間(需時僅1天左右)，同時明顯減少培養物污染機會，重復性好。2.血清學檢測抗體實驗室比較常用的診斷方法為血清抗體的測定，具體檢測方法有可分為抗原直接檢測法和抗體間接檢測法。抗原直接檢測法由于某些病毒不產生可檢測的抗原而導致靈敏度低，抗體間接檢測法由于皰疹病毒感染后需1周左右才產生有效濃度的抗體而無法進行早期診斷，且不同皰疹病毒間存在交叉反應，抗體特異性不高。

目前，血液中EB病毒DNA檢測主要采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術。熒光定量PCR又稱實時定量PCR，是近年開發出來的全新PCR技術，可以全程、動態、不間斷地光學監控被熒光標記的PCR反應，以此來評價被檢測標本中的DNA含量，能反映PCR擴增動力學變化，實現實時定量檢測，具有快速、準確、不易被污染等優點。但是，在實際運用中，除PCR本身外，核酸提取效率和抗干擾能力對PCR準確檢測EB病毒核酸含量有很大影響。

國內臨床上主要采用直接煮沸法、酚-氯仿抽提法對血漿或血清樣本中的EB病毒核酸進行提取，直接煮沸法提取過程較復雜，且在處理樣本時經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，同時直接加熱法提取的核酸模板中含有較多的雜質，這些存在的雜質會干擾檢測的進行，如蛋白質、肝素等，所以往往需要將核酸提取液進一步純化，純化工序冗長且往往達不到預期效果。

中國專利申請CN103060473A公開了一種皰疹類病毒EBV檢測試劑盒，其包括核酸釋放劑等組分。該核酸釋放劑提取核酸時采用強烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放出病原體核酸，無需加熱即可完成DNA的釋放和提取。雖然用核酸釋放劑提取核酸具有快速、簡便等優點，但是核酸樣品含雜質較多，且整體的提取效率不高，影響了試劑盒的檢測準確度。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種檢測EBV的探針，該探針覆蓋深度高；本發明的目的之二在于提供檢測EBV的方法，該方法檢測準確度高。