[發明專利]甲硫氨酸合成酶突變體、突變基因及其在制備維生素B12

有效

• 申請號: 202010012124.7
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN110819605B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 張大偉;董會娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/74;C12P19/42;C12N13/00;C12N1/20;C12R1/41
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開一種甲硫氨酸合成酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。在苜蓿中華根瘤菌中過表達的所述甲硫氨酸合成酶基因和突變基因的基因工程菌，其生產維生素B₁₂的能力得到了大幅提高，并且對發酵培養時的生物量幾乎沒有任何影響，具有較大的應用推廣價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到甲硫氨酸合成酶突變體、突變基因及其在制備維生素B₁₂中的應用。

背景技術

維生素 B₁₂ (VB₁₂)在藥物和食品工業中具有廣泛的應用，其又叫鈷胺素，屬于咕啉類化合物，是唯一含金屬元素的維生素類化合物，是B族維生素發現最晚的大分子有機化合物。根據咕啉環上方的配基（R基團）種類不同，維生素B₁₂可分為：羥基鈷胺素，脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。維生素B₁₂參與了大量的生化反應過程包括DNA的合成和調控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能力的產生。

由于維生素B₁₂分子結構復雜，化學法人工合成需要消耗大量的人力與物力，而且合成周期長。在合成過程中對操作人員的要求過高，導致不能大量的生產。微生物發酵法目前是生產維生素B₁₂的最廉價的方法，能夠大量生產并推廣其使用。

目前，國內外針對維生素B₁₂生產菌生物合成維生素B₁₂的研究主要集中在發酵過程優化，主要涉及培養基包括碳氮源和金屬離子的優化、甜菜堿的添加、魚藤酮的添加，工藝條件包括pH和供氧的控制等。有文獻報道通過在脫氮假單胞菌基因組上表達單拷貝的透明顫菌vgb 基因來增加細胞生產維生素B₁₂的能力（程立芳等, 不同來源的尿卟啉原 III轉甲基酶在脫氮假單胞菌中的表達及其對生產維生素 B12 的影響. 工業微生物，2017，第47 卷第 3期）。

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是廣泛存在于生物體內的一種重要中間體，參與多種類型的生化反應，主要包括轉甲基、轉硫和轉氨丙基。在細胞內，SAM是由S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosy-L-methionine synthetase, SAMS, EC2.5.1.6）催化三磷酸腺苷（ATP）和底物L-甲硫氨酸（L-Met）合成的。5-甲基四氫葉酸-高半胱氨酸甲基轉移酶，又叫甲硫氨酸合成酶（5-methyltetrahydrofolate--homocysteine methyltransferase, EC:2.1.1.13），是催化N⁵一甲基四氫葉酸的甲基轉移到半胱氨酸上生成甲硫氨酸的酶（Han G et al,Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to produce S-adenosyl-L-methionine. Enzyme Microb Technol. 2016 Feb;83:14-21. doi:10.1016/j.enzmictec.2015.11.001.）。 SAM是維生素B₁₂合成的重要甲基供體，而甲硫氨酸的供給對SAM的合成至關重要。目前，尚未有甲硫氨酸合成酶編碼基因metH用于維生素B₁₂合成的報道。

發明內容

本發明人前期篩選出了一株高產維生素B₁₂的苜蓿中華根瘤菌CGMCC NO.9638菌株（CN104342390A），可發酵生產維生素B₁₂。通過對其進行誘變，獲得產維生素B₁₂能力提高的誘變菌株，再挖掘分析其中能夠增加產維生素B₁₂的能力相關的基因，本發明其中甲硫氨酸合成酶基因及其突變基因對于苜蓿中華根瘤菌產維生素B₁₂的能力有重要影響，因而做了進一步研究，最終完成本發明。