[發明專利]新城疫、鴨大舌病二聯卵黃抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202010000056.2
• 申請日: 2020-01-01
• 公開（公告）號: CN111087466A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 安同偉;高彬;馮海波
• 申請（專利權）人: 天津赫萊恩特生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種新城疫、鴨大舌病二聯卵黃抗體的制備方法，其特征在于：選取兩種基礎毒種利用易感鴨胚分別制得免疫原抗原，然后按比例配制呈油乳佐劑免疫原，對未經免疫的健康產蛋雞進行免疫接種，收集高免蛋，并從其蛋黃中提取新城疫、鴨大舌病二聯卵黃抗體。

2.根據權利要求1所述的一種新城疫、鴨大舌病二聯卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)免疫原抗原的制備

病毒的增殖：將新城疫病毒毒株和鴨大舌病病毒毒株分別用滅菌生理鹽水稀釋至200ELD₅₀/0.1ml，經尿囊腔分別接種10-11日齡易感鴨胚，每胚0.1-0.2ml，置37℃孵育24小時，照胚棄去24小時內的死胚；對接種24小時后的鴨胚，每4小時照胚一次，將死亡胚放2-8℃冰箱；收集24-120小時死亡鴨胚的尿囊液及胚體，勻漿后，反復凍融2次，再以4200r/min離心20-30分鐘，收集上清液，分別定量分裝于無菌安培瓶中，注明收獲日期、毒種代次，冷凍保存備用；

接種：用滅菌生理鹽水將增殖所得兩種種病毒毒種分別稀釋10³-10⁵倍，經尿囊腔接種10-11日齡易感鴨胚，每胚0.1-0.2ml，封孔后，置36-37℃繼續孵育120小時，不必翻蛋；

孵育：接種后24小時開始照胚，棄去24小時內的死胚，之后每4小時照胚一次，24-120小時死亡的鴨胚隨時取出，置于2-8℃冷卻12-24小時；

收獲：將冷卻的鴨胚取出，用碘酊消毒氣室部位，無菌收集典型病變鴨胚的尿囊液和胚胎，收集時逐個檢查胚胎病變，凡胚胎腐敗、胚液渾濁或胚胎無新城疫或鴨大舌病所引起的特征性病變者，棄去不用；每個毒種的5-8枚鴨胚的尿囊液和胚胎混為1組，勻漿后反復凍融2次，再以4200r/min離心30分鐘，分別取兩種病毒上清液置于滅菌容器內，記為A即新城疫病毒液、B即鴨大舌病毒液，均置于-20℃保存備用。

病毒液滅活：將AB兩種病毒液分別加入10％的甲醛溶液，隨加隨搖使其充分混合，使甲醛溶液的終濃度為0.1％，37℃條件下滅活24小時，期間每4小時搖晃一次，滅活完畢，滅活后的病毒液置2～8℃保存，有效期為30日；

(2)油乳佐劑免疫原的配制：

油相制備：10號白油94份、司本-806份、硬脂酸鋁2％，硬脂酸鋁與少量白油混合加熱溶化后，再加入司本-80充分攪拌，補足白油，混勻后分裝，116℃30分鐘滅菌后備用；

水相制備：將新城疫病毒及鴨大舌病抗原按(v/v)1:1比例配置的滅活病毒液96份、吐溫-804份，吐溫-80事先加入帶玻璃珠的瓶中滅菌，然后加入少量步驟(1)中所得滅活病毒液，震蕩使吐溫-80完全溶解；最后加入余下的滅活病毒液，充分震蕩混勻；

配比：按油相與水相3:2(v/v)的比例進行配制，先取3份油相置組織搗碎機內，慢速攪拌的同時緩緩加入2份水相，加完后再以10000r/min攪拌5-8分鐘，使混合物充分乳化；乳化后，取樣10ml，以3000r/min離心15分鐘，如不分層，終止攪拌，無菌操作分裝至250ml無菌玻璃瓶中得新城疫、鴨大舌病二聯病毒油乳佐劑免疫原D，并在玻璃瓶外壁注明名稱、制備時間、裝量等；

(3)高免蛋生產與收集

高免蛋的生產：選擇健康的未經免疫的產蛋雞，用步驟(2)中配比后所得新城疫、鴨大舌病二聯病毒油乳佐劑免疫原D對雞群進行產蛋前免疫，包括基礎免疫、加強免疫、強化免疫、維持免疫；

高免蛋收集：強化免疫接種后，從第14日開始，每隔3日抽樣高免蛋，按蛋黃與滅菌生理鹽水1:3(v/v)稀釋，加入與原蛋黃等體積的三氯甲烷，充分振搖，離心分離上清液，即為待測樣品E，當兩種病毒毒株抗體效價達到一定數值，即為高免蛋最佳收集時間，且收集的高免蛋于10～15℃環境中，放置時間應不超過10日；

(4)卵黃抗體的制備

蛋殼消毒：清洗干凈步驟(3)中收集的高免蛋，然后將其浸入0.1％新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，取出晾干后，再用環氧乙烷氣霧消毒30分鐘；

蛋黃分離：采取手工打蛋或機械打蛋，打蛋時應充分取出蛋清(白)、胚盤和系帶，收集蛋黃；將收集的蛋黃充分攪拌，使蛋黃呈均勻膏狀，加入與蛋黃等體積的滅菌注射水，攪拌混勻后，60-65℃保溫(滅活)30分鐘；

酸化萃取：向無菌的酸化罐中先加入蛋黃體積6倍的酸化用水(預先用無水乙酸鈉及冰乙酸制備，pH值5.0，冷卻至4℃)；然后，倒入蛋黃分離并滅活后的蛋黃液、邊加邊攪拌，待蛋黃液的溫度降至4℃時，保溫靜置2-4小時；酸化完成后，離心取上清液，然后向上清液中加入終濃度為0.1％的正辛酸做滅活劑和萃提劑，攪拌，室溫放置2-6小時；

濃縮：將加辛酸處理好的卵黃液用孔徑5μm和1μm的筒式濾芯過濾，再用截留分子量為10kD的中空纖維超濾柱進行濃縮3-4倍，用NaOH調整濃縮液PH值至6.8-7.2，用0.45μm和0.22μm筒式濾芯進行過濾除菌后，按終濃度為0.1％加入甲醛溶液，充分攪拌均勻，密閉滅活2小時后定量分裝，加蓋密封，2-8℃保存，即得新城疫、鴨大舌病二聯卵黃抗體。