[發明專利]利用啟動子工程化設計醇脫氫酶2(ADH2)啟動子變體

在審

• 申請號: 201980061205.1
• 申請日: 2019-09-23
• 公開（公告）號: CN112739819A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: P·卡里克;B·貢杜茲·埃貢
• 申請（專利權）人: 中東科技大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/79
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 張培源;龐東成

1.乙醇和甲醇誘導條件下的巴斯德畢赤酵母醇脫氫酶2(ADH2)啟動子變體，其在野生型巴斯德畢赤酵母ADH2啟動子(SEQ ID No.1)的核苷酸1至948(-1047至-100)中包含至少一個突變。

2.設計啟動子變體的方法，其中，巴斯德畢赤酵母ADH2啟動子包括以下突變：在核苷酸647至660(-401至-388)、739至752(-309至-296)、100至1000(-948至-48)內的任意位置，整合Cat8轉錄因子結合位點(TFBS)，特別是整合“TTCCGTTCGTCCGA”基因序列或與該序列具有至少80％相似性的其他基因序列；核苷酸15至848(-1033至-200)內的由SEQ ID NO.2指定的突變，及它們的組合。

3.如權利要求2所述的啟動子變體構建方法，其中，通過缺失、替換、插入和/或倒位來使核苷酸突變。

4.一種表達盒，所述表達盒包含：至少一種權利要求1、2或3中任一項所限定的ADH2啟動子變體；和至少編碼蛋白(肽)或功能性核苷酸的核酸分子，所述啟動子變體和核酸分子形成單拷貝或多拷貝表達盒。

5.如權利要求4所述的表達盒，其特征在于，所述啟動子和所述核酸可操作地連接在一起。

6.一種載體，所述載體包含權利要求1、2或3中任一項所限定的巴斯德畢赤酵母醇脫氫酶2(ADH2)啟動子變體和至少權利要求4所述的核酸分子。

7.一種細胞，所述細胞包含至少一種權利要求1、2或3中任一項所限定的巴斯德畢赤酵母醇脫氫酶2(ADH2)啟動子變體和至少權利要求4所述的表達盒或至少權利要求6所述的載體。

8.如權利要求7所述的細胞，其中，所述細胞是真核細胞，特別是酵母細胞，優選甲醇營養型酵母細胞，優選選自由畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬和球擬酵母屬組成的組的酵母細胞，尤其是巴斯德畢赤酵母細胞。

9.一種重組蛋白、肽或功能性核酸的表達方法，所述方法包括以下步驟：

-提供權利要求4所述的表達盒或權利要求6所述的載體，所述表達盒或載體包含權利要求1、2或3中任一項所限定的ADH2啟動子變體和編碼權利要求4或5所限定的蛋白、肽或功能性核酸分子的核酸分子，

-用所述載體或核酸分子轉化權利要求7或8所述的細胞，

-在合適的培養基中培養轉化的細胞，

-優選地，進行所述蛋白、肽或功能性核酸分子的可誘導表達，

-分離所產生的蛋白、肽或功能性核酸分子。

10.如權利要求9所述的方法，其中，所述細胞是權利要求7或8所述的酵母細胞，優選甲醇營養型酵母細胞，優選選自由畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬和球擬酵母屬組成的組的酵母細胞，尤其是巴斯德畢赤酵母細胞。

11.重組蛋白、肽或功能性核酸分子的生產方法，其特征在于使用權利要求4所述的表達盒、權利要求6所述的載體或權利要求7或8所述的細胞。