[發(fā)明專利]檢測核酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201980056773.2
• 申請日: 2019-08-26
• 公開（公告）號: CN112639119A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設計）人: M.F.羅伯茨;S.M.張
• 申請（專利權(quán)）人: 葛蘭素史密斯克萊知識產(chǎn)權(quán)發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 易方方

本發(fā)明涉及用于檢測包含絮凝劑和重組蛋白的樣品中的核酸的方法，所述方法包括：(a)向所述樣品中添加肝素和洗滌劑，(b)擴增至少一部分核酸，以及(c)檢測步驟(b)中的擴增，從而檢測所述樣品中的所述核酸。本發(fā)明還涉及用于檢測包含絮凝劑和重組蛋白的樣品中的核酸的方法，所述方法包括：(a)向樣品中添加洗滌劑和氫氧化鈉，(b)擴增至少一部分核酸，以及(c)檢測步驟(b)中的擴增，從而檢測所述樣品中的所述核酸。

本發(fā)明涉及在用于定量重組蛋白樣品中的核酸的測定中減少干擾的方法，其通過向樣品中添加肝素和洗滌劑，或向樣品中添加洗滌劑和氫氧化鈉，或向樣品中添加洗滌劑并將樣品的pH調(diào)節(jié)到至少約8。

技術背景

重組蛋白的大規(guī)模制造是生物技術行業(yè)的一項重要挑戰(zhàn)。重組蛋白通常通過宿主細胞培養(yǎng)或通過無細胞系統(tǒng)產(chǎn)生。在每種情況下，從包含雜質(zhì)的樣品中純化蛋白質(zhì)至足以用作人治療產(chǎn)品的純度。

典型的方法包括初步澄清以除去固體顆粒，然后純化以確保足夠的純度。澄清可以降低純化期間后續(xù)色譜步驟的負擔。典型的澄清步驟包括離心步驟或過濾步驟或兩者。在澄清之前，可以采用預處理步驟作為調(diào)節(jié)樣品的方法。調(diào)節(jié)預處理步驟的一個實例是絮凝，絮凝使固體顆粒形成較大的聚集體，然后通過澄清除去這些聚集體。PEI(聚乙烯亞胺)是一種絮凝劑，廣泛用于抗體純化方法中。

在生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)期間，殘留宿主細胞DNA是雜質(zhì)，需要對其進行定量以確保其含量在可接受的水平內(nèi)。殘留DNA的水平通常在整個生產(chǎn)過程和原料藥釋放中受到嚴格監(jiān)測和控制。實時定量PCR(qPCR)是一種廣泛接受的用于定量重組治療性蛋白質(zhì)中的殘留DNA的方法。然而，樣品(例如，過程中或原料藥樣品)中的殘留PEI強烈抑制殘留DNA qPCR測定和用于產(chǎn)品質(zhì)量和生物制藥產(chǎn)品的釋放測試中的許多其他測定。通常，由于存在濃度大于或等于20ppm的PEI，需要非常高的樣品稀釋度(例如1:10,000)來克服測定干擾。如此稀釋樣品對于滿足關于每腸胃外劑量存在的殘留宿主細胞基因組DNA的量(例如10ng/劑量)的管理要求所需的測定靈敏度產(chǎn)生很大風險。

因此，需要用于改進定量重組蛋白樣品中的殘留宿主細胞DNA的測定靈敏度的方法。

發(fā)明內(nèi)容

在一方面，提供了用于檢測包含重組蛋白和絮凝劑的樣品中的核酸的方法，所述方法包括：

(a)向所述樣品中添加洗滌劑和氫氧化鈉(NaOH)，

(b)擴增至少一部分核酸，以及

(c)檢測步驟(b)中的擴增，從而檢測所述樣品中的所述核酸。

在另一方面，提供了用于檢測包含重組蛋白和絮凝劑的樣品中的核酸的方法，所述方法包括：

(a)向所述樣品中添加洗滌劑，

(b)將所述樣品的pH調(diào)節(jié)到至少約8，

(c)擴增至少一部分核酸，以及

(d)檢測步驟(c)中的擴增，從而檢測所述樣品中的所述核酸。

在又一方面，提供了用于檢測包含絮凝劑和重組蛋白的樣品中的核酸的方法，所述方法包括：

(a)向所述樣本中添加肝素和洗滌劑，

(b)擴增至少一部分核酸，以及

(c)檢測步驟(b)中的擴增，從而檢測所述樣品中的所述核酸。

附圖說明

圖1A是示出聚乙烯亞胺(PEI)的分子結(jié)構(gòu)的示意圖。示出了PEI的重復單元(頂部)和示例性分支PEI片段(底部)。圖1B是示出PEI結(jié)合DNA并形成復合物的示意圖。圖1C是示出肝素的分子結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖2是示出在不同條件(例如是使用不同洗滌緩沖液和洗脫緩沖液的處理條件)下獲得的樣品中的回收率的表。