[發明專利]增強基因組工程化效率的方法

在審

• 申請號: 201980053117.7
• 申請日: 2019-06-14
• 公開（公告）號: CN112567042A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 孟玲
• 申請（專利權）人: 科沃施種子歐洲股份兩合公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 區斌

1.一種用于在植物細胞中遺傳修飾的方法，所述方法包含

(a)將以下共同導入所述植物細胞

(i)基因組工程化組分，和

(ii)第二化合物，其包含

(ii.1)表觀遺傳調控化學物質或其活性衍生物，特別是DNA甲基轉移酶抑制劑或蛋白質脫乙酰基酶抑制劑，優選地是組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(HDACi)，和/或

(ii.2)植物激素或其活性衍生物，其優選地選自生長素、細胞分裂素及其組合，和/或

(ii.3)引起從體細胞、愈傷組織細胞或胚性細胞的植物再生得以改善的蛋白質或包含編碼所述蛋白質的核酸的表達盒，和

(b)在允許在存在所述第二化合物時通過基因組工程化組分的活性來遺傳修飾所述植物細胞的基因組的條件下培養所述植物細胞，

優選地，其中所述基因組工程化組分(i)和/或所述第二化合物(ii)在所述植物細胞中是瞬時有活性的和/或是瞬時存在的。

2.權利要1的方法，其中所述基因組工程化組分包含

a)雙鏈DNA斷裂(DSB)誘導酶或編碼其的核酸，其優選地識別所述細胞的基因組中的預定位點，以及任選地包含修復核酸分子，或

b)單鏈DNA或RNA斷裂(SSB)誘導酶或編碼其的核酸，其優選地識別所述細胞的基因組中的預定位點，以及任選地包含修復核酸分子，或

c)堿基編輯器酶，其任選地與解除武裝的DSB誘導酶或SSB誘導酶融合，所述解除武裝的DSB誘導酶或SSB誘導酶優選地識別所述細胞的基因組中的預定位點，或

d)影響DNA甲基化、組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、組蛋白泛素化，組蛋白磷酸化、組氨酸SUMO化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化的酶，其任選地與解除武裝的DSB誘導酶或SSB誘導酶融合，所述解除武裝的DSB誘導酶或SSB誘導酶優選地識別所述細胞的基因組中的預定位點。

3.權利要求1或2的方法，其中所述基因組工程化組分包含選自以下的DSB誘導酶或SSB誘導酶或其變體：CRISPR/Cas內切核酸酶，優選地CRISPR/Cas9內切核酸酶或CRISPR/Cpf1內切核酸酶，鋅指核酸酶(ZFN)，歸巢內切核酸酶，大范圍核酸酶和TAL效應物核酸酶。

4.前述權利要求中的任一項的方法，其中步驟(b)中的所述基因組工程化組分的瞬時活性包含在所述植物細胞的基因組中誘導一個或多個雙鏈斷裂，在所述植物細胞的基因組中誘導一個或多個單鏈斷裂，在所述植物細胞的基因組中誘導一個或多個堿基編輯事件，或在所述植物細胞的基因組中誘導一個或多個DNA甲基化、組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、組蛋白泛素化，組蛋白磷酸化、組氨酸SUMO化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化。

5.權利要求4的方法，其中在誘導一個或多個雙鏈斷裂或一個或多個單鏈斷裂之后為非同源末端連接(NHEJ)和/或通過同源重組機制(HDR)對斷裂的同源性定向修復。

6.前述權利要求中的任一項的方法，其中在步驟(b)中所述基因組的修飾選自

a)取代至少一個核苷酸；

b)缺失至少一個核苷酸；

c)插入至少一個核苷酸；

d)DNA甲基化的改變，

e)組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、組蛋白泛素化，組蛋白磷酸化、組氨酸SUMO化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化的改變，或

f)a)-e)的任何組合。

7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述引起從體細胞、愈傷組織細胞或胚性細胞的植物再生得以改善的蛋白質包含選自以下的氨基酸序列：

a)如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任何一個所示的序列，

b)具有與(a)的序列至少60％相同性的序列，

c)由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32中任何一個所示的核酸序列編碼的序列，和

d)由具有與(c)的核酸序列至少60％相同性的核酸序列編碼的序列。