[發(fā)明專利]用于解析核酸混合物和混合細(xì)胞群體的方法和試劑及相關(guān)應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980037564.3
• 申請日: 2019-05-16
• 公開（公告）號: CN112218956A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·J·索爾克;C·C·瓦倫丁三世;P·達(dá)那赫;羅方吟
• 申請（專利權(quán)）人: 特溫斯特蘭德生物科學(xué)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B30/10;G16B20/20;G16B20/50
• 代理公司: 深圳市百瑞專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44240
• 代理人: 金輝

本文公開了用于評估和解析核酸混合物和/或混合細(xì)胞群體的方法和相關(guān)試劑。本技術(shù)的一些實(shí)施例涉及利用雙重測序來評估和解析樣品中的核酸混合物(例如，多嵌合體混合物、來自多于一個來源的核酸的混合物等)和相關(guān)應(yīng)用。其他實(shí)施例涉及檢測和定量來自混合物的核酸的供體來源。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2018年5月16日提交的美國臨時專利申請第62/672,573號和2019年2月27日提交的美國臨時專利申請第62/811,517號的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，它們的公開通過引用以其整體并入本文。

背景技術(shù)

解析來自不同克隆或個體的混合細(xì)胞群體，或追蹤核酸混合物中的原始來源，通常需要追蹤在對混合物有貢獻(xiàn)的克隆或個體之間不同的特異性遺傳標(biāo)記物。雖然有時可以通過非遺傳手段(即在細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)的差異等)區(qū)分來自不同克隆或個體的細(xì)胞，但這并不總是可能的，或者對于高通量使用在實(shí)驗(yàn)上可能是不切實(shí)際的。遺傳多態(tài)性可以用作一種方便的、可預(yù)測的和統(tǒng)計上可推廣的譜系標(biāo)記物，用于定義細(xì)胞或DNA分子的來源。例如，在人類中，約0.1％的人類基因組是多態(tài)性的(例如，在人類群體中，每1000個核苷酸堿基中有一個在序列上不同)。常見的變異形式可以包含單核苷酸多態(tài)性/單核苷酸變體(SNP/SNV)、多核苷酸變異(MNV)、短插入和缺失(indel)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)長度的變異以及其他更大規(guī)模的結(jié)構(gòu)變異，諸如染色體間或染色體內(nèi)重排、復(fù)制、缺失、串聯(lián)復(fù)制和倒位等。

一般而言，當(dāng)對個體進(jìn)行基因分型時，可以通過解析基因型中的這些多態(tài)性差異來區(qū)分每個個體的各自身份。當(dāng)使用短讀下一代DNA測序(NGS)平臺用于基因分型時，SNP是用于區(qū)分不同個體的最豐富和最方便的多態(tài)性形式之一。給定的多態(tài)性位點(diǎn)的總體群體變異程度通常由次要等位基因頻率(MAF)來描述，次要等位基因頻率是群體中第二個最常見變體的頻率(即如從記錄的變異(諸如dbSNP)的數(shù)據(jù)庫中確定)。作為示例，0.5的MAF通常意味著在群體中每個等位基因存在50％的豐度，并且0.05的MAF通常意味著存在一個等位基因的5％的豐度和另一個等位基因的95％的豐度，盡管也可以存在較低頻率的等位基因(即一個變體為5％，另一個為92％和第三個為3％)。通常，被查詢的多態(tài)性位點(diǎn)越多，兩個或更多個體就越可能彼此區(qū)分(圖1)。因?yàn)榛蚪M的相鄰部分通常是共遺傳的(即，在連鎖不平衡中)，所以評估基因組的不同區(qū)域中(即，在不同的染色體上)的多個多態(tài)性位點(diǎn)對于最大化能夠有效地區(qū)分來自不同個體的細(xì)胞混合群體的兩個或更多個個體貢獻(xiàn)者的機(jī)會通常是有利的。

已經(jīng)解析和定量來自不同個體的細(xì)胞的混合物的一種方法是單細(xì)胞分析方法(圖2)，其中對個體細(xì)胞進(jìn)行基因分型(對來自每個獨(dú)立細(xì)胞的DNA或RNA進(jìn)行測序，并且對每個獨(dú)特的基因型進(jìn)行計數(shù))。這可以通過在單個試管、板孔、液滴等中將每個細(xì)胞處理為不同的實(shí)體來實(shí)現(xiàn)，使得來自每個細(xì)胞的衍生序列讀數(shù)可以連接回該相同的細(xì)胞(通常使用某種形式的單細(xì)胞條形碼技術(shù)，即，PMID 28091601、PMID 2954551、PMID 30087104)。這種方法是有利的，因?yàn)閬碜詥蝹€細(xì)胞或大DNA分子的許多多態(tài)性標(biāo)記物的基因型可以在信息上連接在一起，然而，這些方法通常是復(fù)雜的、昂貴的并且經(jīng)常需要完整的細(xì)胞或其他特殊的材料制備。

另一種方法是單分子分析，其中混合和生長在一起的細(xì)胞具有大量提取和基因分型的核酸，并且計數(shù)單個多態(tài)性位點(diǎn)的相對豐度。結(jié)果可以在計算上去卷積，并且與來自每個單獨(dú)來源的已知基因型進(jìn)行比較(圖3)。在細(xì)胞內(nèi)不含的DNA分子的混合物可以類似地進(jìn)行基因分型和去卷積。這種方法比單細(xì)胞基因分型更簡單，但可能需要測序至更高的深度并評估更多的多態(tài)性位點(diǎn)，以從技術(shù)上解析混合物。這種方法還可能需要高得多的測序準(zhǔn)確度，這對于常規(guī)的NGS方法來說可能是限制性的，尤其是當(dāng)混合物的復(fù)雜性增加時。

發(fā)明內(nèi)容