[發明專利]具有高空間分辨率的時間分辨成像方法

有效

• 申請號: 201980010127.2
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN111971606B
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 朱塞佩·維克多米尼;馬爾科·卡斯泰洛;喬治·托塔羅洛;阿爾貝托·托斯;毛羅·布塔法瓦;費代里卡·維拉;保羅·比安基尼;阿爾貝托·迪亞斯普羅;科林·J·R·謝潑德
• 申請（專利權）人: 意大利學院科技基金會;米蘭綜合工科大學;熱那亞大學
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B27/58
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 石磊

一種用于操作點激光掃描顯微鏡的方法，包括：利用聚焦的照明激光束(EB)掃描樣本；借助于檢測元件(23)的陣列，在通過所述激光束的掃描下記錄所述樣本的多個圖像，其中，所述檢測元件(23)能被配置為強度模式或能被配置為時間分辨模式，在所述強度模式中，記錄的圖像是與在所述照明束在各個位置n上的整個停留時間期間收集的光子有關的強度圖像g_i，j(n)，在所述時間分辨模式中，記錄的圖像是時間分辨圖像在所述時間分辨模式中，收集的光子基于它們到達各個檢測元件(23)的時間來區分；通過在所述照明束(EB)在所述樣本上的所有位置n上對所述多個強度圖像g_i，j(n)求和，計算指紋圖像a，所述指紋圖像同時取決于以下被稱為照明PSF，h^exc的照明點擴展函數和以下被稱為檢測PSF，h^det的檢測點擴展函數，從所述強度圖像g_i，j(n)估計移位矩陣s^x和s^y，重建以下項中的至少一者：i)時間分辨對象函數f^t，以及ii)強度對象函數f，并且基于所述時間分辨對象函數和強度對象函數，使高分辨率時間分辨圖像f^t～和高分辨率強度圖像f^～中的至少一者可視化。

技術領域

本發明涉及光學顯微鏡技術。

背景技術

光學顯微鏡是生命科學中最強大的分析工具之一，這是因為它允許利用高時空分辨率使活體樣本(從細胞到組織、器官到動物)的三維形態可視化。當與熒光結合使用時，光學顯微鏡(熒光光學顯微鏡)可以提供高分子特異性和敏感性，這允許了解出現在活體樣本中的生物分子過程。實際上，由于許多方案和標記方法使得熒光分子(被稱為熒光團)可以以高特異性與樣本內的感興趣生物分子(例如，蛋白質)結合。光學顯微鏡將光聚焦在樣本上以引起熒光現象，并且僅使感興趣生物分子可視化。熒光是這樣的過程：通過該過程，熒光團在被具有特定能量的光子吸收(SPE) 而被激發后，發射具有較低能量的光子(自發發射)。在多光子激發(MPE) 中，激發熒光團所需的能量通過“同時”吸收較小能量的多個光子來獲得。將通過感興趣生物分子產生的熒光與散射/反射光光譜分離的光學顯微鏡提供感興趣生物分子的特定且高度敏感的三維圖。

此外，熒光團可以用作傳感器，以提取關于感興趣生物分子的其他重要信息。例如，熒光可以用于研究放置生物分子的環境的特性或了解其與其他生物分子的接近。在許多情況下，這可以通過測量所謂的平均熒光壽命來實現。當處于激發態時，熒光團具有會被去激發的若干途徑(包括自發發射或熒光)；因此，熒光團進入到激發態的時間是隨機過程。熒光團在上述激發態下所花費的平均時間被表示為激發態的平均壽命(或平均熒光壽命)。熒光團附近的其他分子的存在可能改變去激發途徑的速率(或瞬時概率)，從而改變熒光團的平均壽命。因此，通過監測熒光團的平均壽命，通常可以(間接)檢測其他分子的存在(例如，針對pH檢測)。另一選擇是使用共振能量轉移(FRET)機制來測量兩個熒光團(一個供體和一個受體)之間的納米級距離。例如，FRET通過將供體熒光團和受體熒光團與大分子的不同亞基結合而廣泛地用于測量結構性大分子變化：結構上的變化導致供體和受體之間的距離上的變化，結果是，供體的平均壽命發生變化。與時間相關的單光子計數(TCSPC)是用于測量激發態的平均壽命的最常用方法之一；此類的實驗也被稱為時間分辨測量。脈沖激光用于在明確定義的時間位置激發熒光團，并且用于向數據獲取裝置提供同步信號。在收集熒光光子后，同一裝置記錄通過檢測器提供的信號。由于激光同步信號，數據獲取裝置測量激發事件與光子記錄、所謂的光子到達時間之間的時間延遲。重復該操作幾次，以構建所謂的光子到達時間直方圖。熒光團的平均壽命可以借助于特別分析從這樣的直方圖中提取，所述特別分析在大多數情況下基于擬合例程或相量變換。由于最常見的熒光團 (有機蛋白或熒光蛋白)具有在1到10ns之間的平均壽命，因此TCSPC 設備的組件必須滿足特定的時間限制：(i)激發脈沖必須具有小的幅值(約一百ps)；(ii)檢測器必須以高時間分辨率(即，以低時間抖動)(不確定性)(幾百ps)記錄單個光子；(iii)數據獲取裝置必須以高時間分辨率(小于100ps)提供同步信號與檢測器的信號之間的延遲。