[發(fā)明專利]CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒

在審

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• 申請日: 2017-03-03
• 公開（公告）號: CN108531558A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設計）人: 張同存;柳浥時;顧潮江;廖興華;文靖
• 申請（專利權）人: 武漢波睿達生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒，涉及生物大分子檢測領域。所述方法包括：第一步：提取待測樣品DNA；第二步：PCR反應：取特異性擴增引物、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，加入待測樣品DNA配成PCR反應液；第三步：進行PCR擴增反應，于每個循環(huán)結束時測定吸光值；第二步中所述特異性擴增引物為：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；本發(fā)明提供能夠有效的追蹤人體內或培養(yǎng)過程中CD22三代嵌合抗原受體含量，提示治療情況并為治療劑量提供參考，效果準確迅速。

技術領域

本發(fā)明涉及生物大分子檢測領域，更具體地說，涉及CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒。

背景技術

嵌合抗原受體（CAR）是單鏈抗體的可變區(qū)和T細胞信號分子的融合蛋白，它使T細胞可以通過非MHC 限制性的方式識別特異性抗原，發(fā)揮殺傷作用。目前，CAR的信號域已從第一代的單一信號分子發(fā)展為包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信號結構域（第二、三代），在體內的存在時間及殺傷能力明顯增強。利用靶向 CD19和CD20的CAR修飾的T細胞進行過繼輸注，治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤是目前臨床研究的熱點。由于CAR-T 細胞是應用基因修飾病人自體的T細胞，利用抗原抗體結合的機制，能克服腫瘤細胞通過下調MHC分子表達以及降低抗原遞呈等免疫逃逸，讓腫瘤細胞無所逃遁；多靶向更精準。CAR既可以利用腫瘤蛋白質抗原，又可利用糖脂類非蛋白質抗原，擴大了腫瘤抗原靶點范圍，CAR-T細胞作用過程不受MHC的限制;殺瘤范圍更廣。CAR技術也正研究用于骨髓移植后的過繼免疫治療等領域。在治療安全性方面，目前臨床試驗中大部分患者對CAR治療耐受性良好。目前大部分的CRA-T技術都處于研發(fā)狀態(tài)，因為細胞毒性和脫靶問題的存在給治療帶來不確定性，所以實時監(jiān)控檢測治療過程中人體內基因表達水平顯得尤為重要。

實時定量PCR檢測方法(real-time PCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法。實時定量PCR在常規(guī)PCR基礎上把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起，能提高靈敏度，且在整個實驗中，所有反應物在同一溶液中進行，不需要任何后處理過程，被測產(chǎn)物的數(shù)量與起始模板拷貝數(shù)直接相關。

隨著自體細胞回輸技術的不斷成熟與完善，對CD22三代嵌合抗原受體的含量檢測要求更加精準，CD22三代嵌合抗原受體含量直接關系是否能夠產(chǎn)生療效。目前沒有一種針對CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒，該方法能夠有效的追蹤人體內或培養(yǎng)過程中CD22三代嵌合抗原受體含量，提示治療情況并為治療劑量提供參考，效果準確迅速。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

CD22三代嵌合抗原受體實時熒光定量PCR檢測方法，所述方法包括：

第一步：提取待測樣品DNA；

第二步：PCR反應：取特異性擴增引物、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物、DNA染料和DNA聚合酶，加入待測樣品DNA配成PCR反應液；

第三步：進行PCR擴增反應，于每個循環(huán)結束時測定吸光值；

第二步中所述特異性擴增引物為：

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。