[發(fā)明專利]一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010640276.1
• 申請(qǐng)日: 2020-07-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111676192A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高力揚(yáng);周曉宇;張揚(yáng);李陶;張立忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏大學(xué);中科寶承生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長(zhǎng)明;許偉群

1.一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括干細(xì)胞的復(fù)蘇、干細(xì)胞的傳代、干細(xì)胞的回輸或凍存，其中：

干細(xì)胞的復(fù)蘇：在水浴鍋中復(fù)蘇凍存的干細(xì)胞，通過(guò)離心操作分離干細(xì)胞與凍存液，添加培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞；

干細(xì)胞的傳代：將含有需要傳代的細(xì)胞的培養(yǎng)液倒入收集瓶，添加鹽水和胰酶消化液清洗培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液終止消化，培養(yǎng)液和消化液倒入離心瓶離心，在離心完成的細(xì)胞沉淀中添加培養(yǎng)液混懸，所得的細(xì)胞懸液中添加培養(yǎng)液傳代；

干細(xì)胞的回輸：將含有需要回輸?shù)募?xì)胞的培養(yǎng)液倒入收集瓶，添加鹽水和胰酶消化液清洗培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液終止消化，培養(yǎng)液和消化液倒入離心瓶離心，取離心完成的沉淀添加鹽水混勻，倒入回輸血袋封口貼標(biāo)簽送至回輸中心；

干細(xì)胞的凍存：將含有需要凍存的細(xì)胞的培養(yǎng)液倒入收集瓶，添加鹽水和胰酶消化液清洗培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液終止消化，培養(yǎng)液和消化液倒入離心瓶離心，取離心完成的沉淀添加凍存液混勻，所得的細(xì)胞懸液加入凍存管，放置在程序降溫盒內(nèi)降溫12h，轉(zhuǎn)入液氮。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細(xì)胞的復(fù)蘇的具體步驟包括：

從液氮罐中取出凍存的干細(xì)胞，

使用水浴鍋溶解復(fù)蘇凍存的干細(xì)胞，

復(fù)蘇完成，轉(zhuǎn)移干細(xì)胞至操作間的凈化工作臺(tái)，

使用移液管將凍存管中的干細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，以1500轉(zhuǎn)速度離心5min，

準(zhǔn)備培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶中添加無(wú)血清培養(yǎng)基，

離心完成，棄上清液留細(xì)胞沉淀，

使用移液管在細(xì)胞沉淀中添加無(wú)血清培養(yǎng)基，吹打至混懸，

培養(yǎng)瓶中添加細(xì)胞懸液，

培養(yǎng)瓶上粘貼標(biāo)簽，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法還包括：

所述無(wú)血清培養(yǎng)基為配置好的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人間充質(zhì)干細(xì)胞添加物，添加物成分包括白蛋白，胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白等營(yíng)養(yǎng)成分。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細(xì)胞的傳代的具體步驟包括：

轉(zhuǎn)移需要傳代的細(xì)胞至凈化工作臺(tái)，

準(zhǔn)備培養(yǎng)瓶、收集瓶和離心瓶，

含有需要傳代的細(xì)胞的培養(yǎng)液倒入收集瓶，

培養(yǎng)瓶中添加鹽水清洗，清洗液倒入離心瓶，

添加胰酶消化液，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，

培養(yǎng)瓶平放至充分消化，添加培養(yǎng)液終止消化，

消化液和培養(yǎng)液倒至離心管，

倒入鹽水清洗培養(yǎng)瓶，清洗液倒入離心瓶，以500G速度離心5min，

棄上清液留細(xì)胞沉淀，添加培養(yǎng)液，

使用移液管混懸細(xì)胞液，混勻后平放至培養(yǎng)箱內(nèi)，粘貼標(biāo)簽。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法還包括：

所述胰酶消化液由胰酶和鹽水1:1調(diào)配而成。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細(xì)胞的回輸?shù)木唧w步驟包括：

準(zhǔn)備離心管和收集瓶，細(xì)胞液倒入收集瓶，

培養(yǎng)瓶中添加鹽水清洗，清洗液倒入離心瓶，

培養(yǎng)瓶中添加胰酶消化液消化2min至充分消化，添加培養(yǎng)液終止消化，

培養(yǎng)液和消化液的混合液倒入離心瓶，以500G速度離心5min，

棄上清液留細(xì)胞沉淀，添加鹽水混勻，

使用注射器注入回輸血袋，熱合機(jī)封口，粘貼標(biāo)簽送回輸中心，細(xì)胞液留樣。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述干細(xì)胞的凍存的具體步驟包括：

準(zhǔn)備離心管和收集瓶，細(xì)胞液倒入收集瓶，

培養(yǎng)瓶中添加鹽水清洗，清洗液倒入離心瓶，

培養(yǎng)瓶中添加胰酶消化液消化2min至充分消化，添加培養(yǎng)液終止消化，

培養(yǎng)液和消化液的混合液倒入離心瓶，以500G速度離心5min，

棄上清液留細(xì)胞沉淀，添加凍存液混勻，

添加細(xì)胞懸液至凍存管，塑封機(jī)封口，

凍存管放置在程序降溫盒中，-20℃放置過(guò)夜轉(zhuǎn)入液氮中，細(xì)胞懸液留樣。