[發(fā)明專利]蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2A的構(gòu)建方法及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110234772.1 | 申請日： | 2021-03-03 |
| 公開（公告）號： | CN113005144A | 公開（公告）日： | 2021-06-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 朱春玉;王旌羽;李輝;張學(xué)敏;高薇;胡媛媛 | 申請（專利權(quán)）人： | 遼寧大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/66;C12N15/40;C12N15/53;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/66;C12R1/93 |
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| 地址： | 110000 遼寧*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 腦炎 病毒 報告 tbev nluc 構(gòu)建 方法 及其 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2A的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明構(gòu)建出了含有Nluc 2A報告基因的報告病毒，使可以通過檢測Nluc熒光素酶信號來監(jiān)測TBEV、研究病毒毒力，并且可作為抗病毒藥物篩選的有力工具。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及蜱傳腦炎病毒(TBEV)報告病毒的構(gòu)建，特別涉及穩(wěn)定表達(dá)含有Nluc熒光素酶的報告病毒的構(gòu)建及其活性檢測。
背景技術(shù)
在中國，第一例人類蜱傳腦炎(TBE)病例于1943年被發(fā)現(xiàn)。TBE在中國的分布與其蜱媒的分布密切相關(guān)。我國TBE病例均為遠(yuǎn)東亞型，由全溝硬蜱傳播。內(nèi)蒙古大興安嶺、黑海龍江小興安嶺、吉林省長白山林區(qū)是東北地區(qū)典型的TBE疫區(qū)。西北地區(qū)的新疆天山北坡林區(qū)和阿爾泰南坡林區(qū)也有間歇性的TBE報告。此外，TBE在云南(中國西南部)和西藏(中國西部)也有報道。由于TBE在中國不是強制報告的傳染病，缺乏對該病的監(jiān)測，其發(fā)病率很可能被低估。并且該病有區(qū)域性、季節(jié)性、職業(yè)性等特征，因此增強我國對該病的檢測和對TBEV的相關(guān)研究以達(dá)到對該病的控制是必要且可行的。
蜱傳腦炎病毒(TBEV)是黃病毒蜱傳類群中最重要的一種。TBEV有一個約11千堿基長的正鏈RNA基因組，基因組包括5'UTR和3'UTR以及一個開放閱讀框(Open readingframe，ORF)，基因組總共編碼3414個氨基酸，并翻譯成單個多蛋白，該多蛋白經(jīng)共轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工成三種結(jié)構(gòu)蛋白(Structural protein，SP)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structuralprotein，nSP)[21]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白有C、PrM和E蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白有NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。相比于其他黃病毒尤其是蚊媒病毒，蜱傳病毒研究相對較少，很多功能是基于其他黃病毒的研究推理出的。
Nluc是熒光素酶系統(tǒng)家族的最新成員，可用于生物發(fā)光應(yīng)用，這種小熒光素酶是從深海蝦中提取的，并經(jīng)過人工優(yōu)化的一種熒光素酶，它的底物是呋喃嗪。Nluc分子量較小，且該系統(tǒng)顯示出比FLuc和RLuc高150倍以上的活性，發(fā)光輸出保持穩(wěn)定，持續(xù)時間比其他的熒光素酶長。因此，在幾種熒光素酶中，Nluc基因在生物發(fā)光和報告基因的應(yīng)用上都比其他熒光素酶更穩(wěn)定、更靈敏。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建出含有Nluc熒光素酶的蜱傳腦炎病毒的報告病毒，使其可以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并且可以通過檢測Nluc熒光素酶信號來研究病毒毒力，可作為抗病毒藥物篩選的有力工具。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：蜱傳腦炎病毒報告病毒TBEV Nluc 2A的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
1)SnaBI-C38片段的克隆：以TBEV感染性克隆為模板，引物1和引物2為特異性引物，PCR擴增蜱傳腦炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列為：
引物1：5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；
引物2：5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；
PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min為一個循環(huán)，進行35個循環(huán)，最后68℃延伸7min。
2)P2A序列和Nluc基因的連接：將P2A序列設(shè)計在引物上，并分兩輪PCR將P2A序列連接到Nluc基因上。
第一輪PCR：以Nluc-pGEMT為模板，Nluc-F和P2A Nluc R1為引物進行PCR，擴增好目的片段后，回收目的條帶。
引物Nluc-F：
5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；
引物P2A Nluc R1：
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