[發明專利]一種表達新城疫病毒F蛋白的傳染性喉氣管炎重組病毒株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201911420496.7
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111041004A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 劉勝旺;邵昱昊;韓宗璽;孫軍峰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/66;C07K14/125;A61K39/295;A61K39/17;A61K39/245;A61P31/20;A61P31/14
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種表達新城疫病毒F蛋白的傳染性喉氣管炎重組病毒株，名稱為rILTV△gC-NDV-F株，其微生物保藏號是：CGMCC No.18534。

2.權利要求1所述的傳染性喉氣管炎重組病毒株的構建方法，其特征在于，步驟如下：

(1)構建含有EGFP表達盒的重組轉移載體：通過PCR擴增獲得傳染性喉氣管炎病毒gC基因兩側的側翼序列，分別記為左同源臂gCL和右同源臂gCR；將左同源臂gCL、右同源臂gCR分別插入PUC18載體中，獲得中間載體pILT△gC；然后插入EGFP表達盒，獲得重組轉移載體pILTΔgC-EGFP；所述重組轉移載體pILTΔgC-EGFP中EGFP表達盒上下游分別連有左同源臂gCL與右同源臂gCR；所述傳染性喉氣管炎病毒gC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)提取傳染性喉氣管炎病毒的完整基因組DNA；

(3)轉染：將步驟(1)中獲得的重組轉移載體pILTΔgC-EGFP與步驟(2)中獲得的傳染性喉氣管炎病毒的完整基因組DNA共轉染LMH細胞，通過蝕斑純化法獲得表達EGFP的傳染性喉氣管炎重組病毒rILTΔgC-EGFP；

(4)構建NDV-F表達盒的重組轉移載體：將步驟(1)所述pILTΔgC-EGFP重組載體中EGFP基因切除，然后插入新城疫病毒F蛋白基因，獲得重組轉移載體pILTΔgC-NDV-F，其中，NDV-F表達盒上下游分別連有左同源臂gCL與右同源臂gCR；

(5)提取步驟(3)中獲得的表達EGFP的傳染性喉氣管炎重組病毒rILTΔgC-EGFP的完整基因組DNA；

(6)轉染：將步驟(4)中獲得的重組轉移載體pILTΔgC-NDV-F與步驟(5)中獲得的表達EGFP傳染性喉氣管炎重組病毒rILTΔgC-EGFP的完整基因組DNA共轉染LMH細胞，通過蝕斑純化法獲得表達NDV-F的傳染性喉氣管炎重組病毒株。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述右同源臂gCR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述新城疫病毒F蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述EGFP表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL與右同源臂gCR擴增所用的模板為雞傳染性喉氣管炎病毒CK/CH/LHLJ/120305株基因組，引物設計所參考的序列GenBank登陸號為NC_006623.1，所述ILTV病毒CK/CH/LHLJ/120305株，其微生物保藏號為CGMCC No.15482。

5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述左同源臂gCL擴增用的引物序列如下：gCL-F：5’-CGCGGATCCatctcaacgcctccttaa-3’，gCL-R：5’-CGGAATTCacttgacgcgcaagctct-3’；所述右同源臂gCR擴增用的引物序列如下：gCR-F：5’-CCCAAGCTTctttctacgaaagaggca-3’gCR-R：

5’-CGCGGATCCgttgagtcgtgaatgccc-3’。