[發明專利]用于檢測與耳聾相關的基因SNP的檢測方法

在審

• 申請號: 201911419327.1
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN112538525A
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 張海燕;馬慶偉;崔紅慧;馬小娟;向華
• 申請（專利權）人: 北京毅新博創生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6872;C12Q1/686;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

1.一種通過與20處耳聾相關基因多態位點的引物組或檢測產品來檢測耳聾相關基因多態位點的方法，包括如下步驟：

(1)多重PCR：使用特異性的PCR引物，在一個反應體系中，直接加入全血樣本，對20處與耳聾相關的基因多態位點所在DNA區域同時進行擴增，得到含20處基因多態位點所在DNA區域的PCR產物；

(2)PCR產物純化：對步驟(1)得到的PCR產物進行純化，以減少對后續反應的干擾；

(3)單堿基延伸：使用7條特異性的延伸引物，在一個反應體系中，對步驟(2)得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與SNP位點處的基因型互補配對；

(4)延伸產物純化：對步驟(3)得到的延伸產物進行純化，以獲得高純的延伸產物，避免鹽離子等雜質對后續檢測的影響；

(5)質譜儀檢測：將步驟(4)得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行進行檢測；

其中，所述20個與耳聾相關的基因多態位點分別是：GJB2基因35delG位點、167delT位點、176_191del16位點、235delC位點和299_300delAT位點；GJB3基因538CT位點和547GA位點；SLC26A4基因281CT、589GA、IVS7-2AG、1174AT、1226GA、1229CT、IVS15+5GA、1975GC、2027TA、2162CT和2168AG；12SrRNA基因1494CT和1555AG。

2.權利要求1的方法，其中，所述引物組包括如下所示的引物：

。

3.權利要求2的檢測方法，其中所述延伸引物及對應的產物分子量為：

。

4.權利要求2或3的方法，其中該檢測產品為檢測試劑盒，包括：

(1)用于PCR的反應試劑，包括：特異性PCR引物，耐高溫的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反應緩沖液；

(2)用于PCR產物純化的試劑；

(3)用于單堿基延伸反應的試劑，包括：延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶，ddNTPs，延伸反應緩沖液。

5.權利要求4的方法，其中該試劑盒還可包括：陰性質控品，陽性質控品，純化用樹脂，點樣及質譜檢測用靶片，外切酶，人基因組DNA提取試劑等試劑。

6.權利要求5的方法，其中用于PCR產物純化的試劑包括：堿性磷酸酶，或堿性磷酸酶和外切酶ExoI，或電泳凝膠回收試劑，或PCR產物純化柱。

7.權利要求6的方法，其中當包括堿性磷酸酶和外切酶ExoI的純化試劑時，所使用的PCR引物無需包括保護堿基。

8.權利要求2-7任一所述的方法，其中步驟2的純化過程可以選自堿性磷酸酶消化、堿性磷酸酶和外切酶ExoI消化、切膠純化、PCR純化柱過柱等。

9.權利要求9的方法，其中當使用堿性磷酸酶消化、或堿性磷酸酶和外切酶ExoI消化進行純化后，進行高溫酶失活處理。