[發(fā)明專利]一種裂解結(jié)合液及糞便磁珠法核酸提取

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• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN110904098A
• 公開（公告）日: 2020-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王少平;秦偉;孟祥和;高龍
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州海基生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

本發(fā)明公開了一種裂解結(jié)合液及糞便磁珠法核酸提取，裂解結(jié)合液的配方包括：10?100mM的緩沖液，2?50mM的EDTA，pH6.5?8.0，0.65M?1.5M的NaCl，1％?5％的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，0.5?5％的PVP?40，0.5％?10％的PEG2000?PEG8000；采用本發(fā)明的裂解結(jié)合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA濃度質(zhì)量高；十六烷基三甲基溴化銨CTAB與PVP?40對裂解具有協(xié)同作用，協(xié)同使用能夠大幅提高提取出來的DNA濃度質(zhì)量；裂解結(jié)合兩步合并為一步法，提取方法的操作簡單，能夠降低操作人員誤操作的幾率，提高提取效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種裂解結(jié)合液及糞便磁珠法核酸提取。

背景技術(shù)

目前核酸提取方法主要有加熱裂解法、酚氯仿抽提法、離心柱法和磁珠法；加熱裂解法是在樣品中加入裂解液，通過加熱的方法裂解細(xì)胞釋放核酸，該方法操作簡便但是提取的核酸純度低，通量低，不利于后續(xù)的檢測，也容易造成污染；酚氯仿抽提因大量使用有毒溶劑，對操作者毒性較大，且難于實(shí)現(xiàn)自動化操作；離心柱法因其核酸提取效率低、成本高，且需要高速離心機(jī)，也難于實(shí)現(xiàn)自動化，均不能廣泛適用于大規(guī)模的臨床檢測。

近年發(fā)展起來的磁珠法核酸提取技術(shù)，其采用超順磁性納米顆粒，利用在高鹽低pH下吸附核酸，然后在低鹽高pH下分離核酸的原理進(jìn)行樣本核酸的分離純化，因其只需要在磁場作用下就能將核酸分離純化出來，故其能實(shí)現(xiàn)高通量自動化標(biāo)準(zhǔn)化操作；而目前市場上的基于磁珠法的商品化試劑操作過于復(fù)雜，并且需要一定溫度下使用蛋白酶K等進(jìn)行孵育，同時需要多步洗滌等步驟，導(dǎo)致其自動化程度偏低，核酸提取的重復(fù)性差及提取效率低。

磁珠法核酸提取的步驟主要包括：(1)裂解；(2)結(jié)合；(3)洗滌；(4)分離四大部分。具體為樣品在裂解液作用下，DNA/RNA釋放出來后與經(jīng)過表面修飾的具有超順磁性納米磁珠進(jìn)行特異性結(jié)合，形成核酸-磁珠復(fù)合物，然后加入洗滌液，洗去非特異性吸附的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后在磁場條件下分離富集磁珠，最后用洗脫液從磁珠上洗脫核酸，得到欲提取的DNA/RNA。

目前市面上常用的磁珠法核酸提取試劑盒一般都是先裂解，然后再加入結(jié)合液，采用的結(jié)合液一般是醇類如異丙醇等溶劑，而異丙醇的使用又不利于環(huán)保。市面上一般的試劑盒都是需要兩種洗滌液分別洗滌兩次，以去除蛋白質(zhì)以及一些鹽類，操作比較繁瑣。

腸道菌群是一群復(fù)雜的微生物總和，由于糞便中所含雜質(zhì)太多，不僅含有動物腸道脫落細(xì)胞，而且含有腸道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、膽堿、膽紅素、植物多糖等，這些雜質(zhì)不但易導(dǎo)致目標(biāo)DNA的降解，還對PCR反應(yīng)有強(qiáng)烈的抑制作用。市場需要一種能夠解決在糞便標(biāo)本核酸提取過程中的一些問題，如裂解效果、簡化操作等，開發(fā)一種簡單高效環(huán)保的磁珠法核酸提取試劑盒，以滿足臨床或是科研日常使用。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種裂解結(jié)合液及糞便磁珠法核酸提取，采用本發(fā)明的裂解結(jié)合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA濃度質(zhì)量高，操作簡單。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種裂解結(jié)合液，配方包括：10-100mM的緩沖液，2-50mM的EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000。

前述的一種裂解結(jié)合液，配方包括：50-100mM的緩沖液，10-20mM EDTA，pH6.5-7.5，1M-1.5M NaCl，1％-3％的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，1-3％的PVP-40，5％-10％的PEG2000-PEG6000。

前述的一種裂解結(jié)合液，100mM的緩沖液，10mM EDTA，pH7.0，1M的NaCl，3％的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，1％的PVP-40，5％的PEG6000。