[發明專利]一種分離、純化和固定化組氨酸標簽蛋白及牛血紅蛋白的新型磁珠的制備方法和應用

有效

• 申請號: 201911408881.X
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN111040030B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 孫恩杰;王宇;胡亞悅;曾凱;李呈祥;謝浩
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K14/00;C07K17/14;H01F1/00;H01F41/00
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 閉釗;崔友明

本發明涉及一種可用于分離、純化和固定化組氨酸標簽蛋白、牛血紅蛋白的新型磁珠及其制備方法和應用。首先利用共沉淀法制備納米四氧化三鐵磁核，然后在該磁核表面直接修飾上若干種不同的羧基化硅烷偶聯劑作為配體，使之可以螯合金屬離子。按照本發明方法制得的磁珠不僅磁性好、性質穩定、易分散，而且還具有合成方法簡單、易于控制和實現等優點，通過磁珠表面的金屬離子與重組蛋白表面組氨酸殘基之間強烈的配位作用穩定結合，能夠高選擇性、高效率的分離純化His?tagged蛋白、牛血紅蛋白等目標蛋白。

技術領域

本發明涉及生物功能材料技術領域，具體涉及一種可用于分離、純化和固定化組氨酸標簽蛋白、牛血紅蛋白的新型磁珠及其制備方法和應用。

背景技術

蛋白質是一類重要的生物大分子，它是一切生命活動的主要承擔者和物質基礎。對蛋白質的結構功能進行研究并最終實現應用的前提和基礎為蛋白質的高效分離純化。常規的蛋白質分離提取技術通常依賴于蛋白質在溶解性、疏水性、分子大小、表面所帶電荷以及特異生物學親和性上的差異，由此發展出了鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法等粗分離方法。此類方法雖然操作簡便、處理量大，但通常分辨率過低，無法有效的分離出目標蛋白。其他蛋白質精細分離技術還有凝膠層析、親和層析、離子交換層析等，這些方法普遍存在價格昂貴、處理量少、對設備要求較高、難以大規模應用等問題。因此建立一種高選擇性、可大規模應用的蛋白質分離技術是當前迫切且極具發展前景的一項任務。

基于金屬螯合層析技術和功能化修飾磁珠發展起來的金屬螯合磁珠是提取分離蛋白質的優良方法，這類磁珠表面修飾的功能化基團通過配位作用與金屬離子牢固結合在一起，而重組蛋白表面所帶的標簽蛋白與金屬離子之間的配位作用便于高選擇性的提取到目標蛋白。這種方法成本相對較低、操作相對簡單，在重組蛋白質的純化中具有明顯的優勢。目前已有不少金屬螯合磁珠被公開報道，也有不少商業化金屬螯合磁珠產品，本發明采用新思路用新途徑制備了一系列新型磁珠。與以往制備方法相比，本發明方法具有成本低、合成路線簡單、效率高等顯著優勢。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種可用于分離、純化和固定化組氨酸標簽蛋白及牛血紅蛋白的新型磁珠的制備方法，該方法具體如下：

(a)保護氣氛下將復合鐵鹽溶于水中，接著加入氨水，調節溶液pH至堿性并升溫進行陳化反應，固液分離得到納米四氧化三鐵磁核，將磁核分散在除氧去離子水中，得到磁核溶液；

(b)以A組分和B組分為原料，制備配體溶液；

(c)將步驟(a)制得的磁核溶液與步驟(b)制得的配體溶液混合，調節混合溶液的pH至酸性并升溫反應，最后固液分離得到磁珠；

其中A組分為γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)或N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH900)，B組分為氯乙酸鈉；或者A組分為γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)，B組分為亞氨基二乙酸；或者A組分為γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)，B組分為亞氨基二乙酸、環氧氯丙烷的混合物。

進一步的，步驟(a)所述復合鐵鹽為水溶性三價鐵鹽和水溶性二價鐵鹽的混合物，兩者的質量比為1:1.0-1.4。所述水溶性三價鐵鹽選自Fe(NH₄)₂·(SO₄)₂或其水合物，所述水溶性二價鐵鹽選自FeCl₃或其水合物。

進一步的，步驟(a)具體過程如下：首先將去離子水煮沸后密封自然冷卻，以便盡可能除去其中的氧；接著在氮氣保護下向去離子水中加入復合鐵鹽使其充分溶解，所得混合物加熱至50-70℃后以200-300r/min的速率攪拌20-40min，然后加入適量氨水調節溶液的pH至10-12，所得混合物繼續加熱至80-90℃，保溫陳化0.5-2h，磁吸附分離后用乙醇和除氧去離子水洗滌所得固體至中性，再加入到除氧去離子水中得到磁核溶液。

進一步的，步驟(b)中配體溶液的制備方法具體如下：