[發明專利]脫敏治療藥物的活性檢測方法

在審

• 申請號: 201911401425.2
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113125744A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 馬永;范宇
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種脫敏治療藥物的活性檢測方法，為其質量控制提供方法學依據。體外測定IgE以確定脫敏治療藥物總生物學活性的方法主要有放射性變應原吸附性實驗(RAST抑制試驗)、免疫印跡試驗等，但這些方法仍然無法做到變應原制劑活性的標準化檢測。本發明建立了一種新型的脫敏治療藥物活性定量檢測方法，包括標準血清庫建立、血清IgE抑制率測算、變應原蛋白活性測算等步驟。該檢測方法重復性好、準確度高，可以有效地反應脫敏治療藥物生物學活性，對脫敏治療藥物的生產工藝研究、質量控制具有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種脫敏治療藥物的活性檢測方法。

背景技術

1998年WHO正式宣布檢測變應原并進行特異性免疫治療是唯一可以影響過敏性疾病自然進程的對因治療方法。特異性免疫治療是確定導致患者過敏的變應原種類后，在非急性期使患者與該種類變應原制劑反復接觸，劑量由小到大逐漸遞增，至最佳維持劑量，提高患者對變應原的耐受性，從而達到控制或減輕過敏癥狀的一種療法。

變應原制劑是將從變應原天然成分中提取或通過基因重組技術制備得到的變應原蛋白，制成一定濃度的溶液，用于診斷、預防和治療的生物制品。變應原生物學活性測定是質量控制的一項重要指標，也是目前變應原制品質量控制的重點和難點。生物單位(biological unit，BU)、生物等效變態反應單位(bioequivalent allergy unit，BAU)，是歐美使用的體內生物學評價單位，以過敏患者皮試結果來標定，反映變應原制品的總活性效價。體外測定IgE以確定變應原總生物學活性的方法有放射性變應原吸附性實驗(RAST抑制試驗)、免疫印跡試驗等。由于缺乏不同批次間穩定的血清池，這些方法仍然無法做到變應原制劑的標準化。

目前國內外尚無統一、標準化的用于脫敏治療的變應原活性檢測方法，所以建立一種變應原制品生物學活性檢測方法，用于制備標準化的變應原尤為迫切。

發明內容

本發明的目的是建立一種用于脫敏治療的變應原蛋白活性檢測方法，為其質量控制提供方法學依據。

首先建立標準血清庫，并對其進行賦值；將變應原蛋白包被在酶標板；將變應原蛋白樣品系列稀釋后與血清庫血清孵育；孵育后的混合物加于預包被了變應原蛋白的酶標板中；建立起“抑制率-稀釋倍數”的線性關系，并規定抑制率為50％的生物學活性為100BU/ml，即可計算出變應原蛋白的生物學活性。

具體地，首先，利用Phadia100過敏原檢測系統對每份血清DP和DF特異性IgE含量進行精確測定；按照正態分布原則，將特異性IgE檢測值為10～150Kua/L進行合并，制備得到標準血清庫；再次利用Phadia100過敏原檢測系統對標準血清庫中DP和DF特異性IgE含量進行精確測定，作為后續方法開發和驗證的標準血清庫。

后續測定方法具體包括以下步驟：

包被：用包被液將變應原蛋白樣品稀釋后加入包被孔中孵育；

封閉：洗滌包被孔，并加入封閉液孵育；

樣品稀釋：待測變應原蛋白樣品梯度稀釋；

混合孵育：將上述稀釋的樣品分別與血清混合孵育；

加樣孵育：孵育好的樣品加入包被孔，繼續孵育；

二抗孵育：包被孔洗滌后加入二抗，孵育；

顯色讀數；

計算：抑制率％＝(陽性值-樣品值)/陽性值，以抑制率％作為橫坐標，以Log₁₀稀釋倍數為縱坐標，做二次曲線擬合；將50％抑制率代入曲線方程，計算出稀釋倍數；生物學活性值(BU/ml)＝稀釋倍數×100；比活(BU/mg)＝生物學活性值/蛋白濃度。