[發(fā)明專利]李斯特屬和6種常見李斯特菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911400110.6
• 申請(qǐng)日: 2019-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN111057776B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳清平;李凡;葉青華;陳謀通;張菊梅;丁郁;吳詩(shī);李瀅;韋獻(xiàn)虎;雷濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所(廣東省微生物分析檢測(cè)中心);廣東環(huán)凱生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;王蘭蘭

本發(fā)明公開了李斯特屬和6種常見李斯特菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測(cè)方法，本發(fā)明方法提供了用于李斯特屬以及6種常見李斯特菌——單核增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、威爾氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌的，共16個(gè)新特異性分子檢測(cè)靶標(biāo)以及對(duì)應(yīng)的PCR引物組和PCR快速檢測(cè)方法。本發(fā)明方法無需經(jīng)過生理生化鑒別即可檢測(cè)到李斯特菌，具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)本發(fā)明的檢測(cè)方法可彌補(bǔ)生化試驗(yàn)鑒別李斯特菌時(shí)反應(yīng)不穩(wěn)定的缺陷，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，結(jié)果判定更簡(jiǎn)單，實(shí)用性更強(qiáng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別李斯特菌的方法，具體涉及李斯特屬和6種常見李斯特菌特異性新分子靶標(biāo)及其快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

李斯特菌(Listeria)是最常見的食源性致病菌之一，廣泛分布于環(huán)境、食品、人和動(dòng)物宿主體內(nèi)。其中單核增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特菌、威爾氏李斯特菌和格氏李斯特菌是最常見的從食品、病人和環(huán)境中分離得到的6個(gè)種，與人類和動(dòng)物的致病性密切相關(guān)。人類感染李斯特菌可引起的李斯特菌病，如腦膜炎、心內(nèi)膜炎、胸肌炎、孕婦流產(chǎn)和敗血癥等，敏感人群主要有老人、新生兒、孕婦和免疫力低下的人群，而感染單核增生李斯特菌的發(fā)病者致死率可達(dá)20％-30％。近年來，我國(guó)部分城市有報(bào)道偶發(fā)李斯特菌病病例，主要人群為孕婦、新生兒等，對(duì)我國(guó)居民的身心健康造成一定的威脅。作為重要的食源性致病菌，如何鑒定和防控李斯特菌污染食品是降低李斯特菌感染的關(guān)鍵之一。

目前，李斯特菌檢測(cè)主要利用國(guó)標(biāo)規(guī)定的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法(GB 4789.30-2016)，該方法需要兩步預(yù)增菌培養(yǎng)，一次選擇性培養(yǎng)，然后對(duì)單克隆菌落進(jìn)行生化鑒定，所獲結(jié)果較為準(zhǔn)確，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)(5d以上)、操作復(fù)雜、成本高，不利于快速檢測(cè)。此外，應(yīng)用生化試驗(yàn)鑒別李斯特菌時(shí)，生化反應(yīng)不穩(wěn)定，結(jié)果獲取依賴主觀判斷，導(dǎo)致生化鑒定結(jié)果重復(fù)性差，容易誤判。以PCR為主的分子生物學(xué)檢測(cè)方法以其快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，逐漸成為取代傳統(tǒng)檢測(cè)方法最具潛力的檢測(cè)技術(shù)之一。

分子生物學(xué)檢測(cè)方法的關(guān)鍵是其目的基因或序列是否具有待檢細(xì)菌的特異性。自上世紀(jì)90年代來，用于檢測(cè)食品和加工環(huán)境中李斯特屬和6種常見李斯特菌的靶標(biāo)基因已有研究報(bào)道，包括：李斯特屬特異性基因prs；單核增生李斯特菌特異性基因hly、actA、inlA、inl、prfA、plcA、ssrA；英諾克李斯特菌特異性基因lin0464、lin2483；威爾氏李斯特菌特異性基因scrA；綿羊李斯特菌特異性基因iactA、nameA、16S rRNA；西式李斯特菌特異性基因lmo0333、Lse24；格氏李斯特菌特異性基因Oxidoreductase等。但近年來在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的靶標(biāo)基因數(shù)量有限，且大部分已報(bào)道基因雖然在其種屬特異性相對(duì)保守，但將這些傳統(tǒng)靶標(biāo)基因進(jìn)行BLAST比對(duì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)與屬內(nèi)或?qū)偻饩暌簿哂休^高的同源性，靶標(biāo)特異性較差，會(huì)增加檢測(cè)過程中的假陽(yáng)性誤檢和假陰性漏檢的概率。此外在細(xì)菌的遺傳進(jìn)化過程中，某些靶標(biāo)如毒力因子受到環(huán)境脅迫或發(fā)生突變或發(fā)生缺失，若僅從該基因來判斷致病菌的存在，容易造成誤判，影響食品安全和人民群眾的生命健康。因此，發(fā)掘李斯特屬和常見李斯特菌種特異性新分子靶標(biāo)，并在此基礎(chǔ)上建立相應(yīng)的PCR檢測(cè)方法是非常必要的。

過去研究者尋找致病菌的特異性基因通常利用誘變技術(shù)、差異表達(dá)和基因芯片來篩選，尤其是毒力基因、耐藥基因、種代謝和結(jié)構(gòu)特殊基因。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，其檢索、儲(chǔ)存和分析功能不斷完善，通過基因組序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中大規(guī)模比對(duì)、搜尋可靠的同源功能基因序列和預(yù)測(cè)候選特異性基因功能及作用位點(diǎn)篩選特異性基因，具有以上傳統(tǒng)分子生物學(xué)無法比擬的優(yōu)勢(shì)，通過生物信息學(xué)方法挖掘和篩選新型的特異性靶點(diǎn)分子不僅可彌補(bǔ)現(xiàn)有靶標(biāo)的不足，而且有助于解決食源性致病微生物快速檢測(cè)方法存在滯后、準(zhǔn)確度差等問題，對(duì)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)行業(yè)的發(fā)展與保障食品安全方面具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容