[發明專利]一種食蟹猴淋巴細胞的流式圈門方法

在審

• 申請號: 201911364355.8
• 申請日: 2019-12-26
• 公開（公告）號: CN113049815A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 張慧;徐青青;孫玉梅;孫倩;魯雯思
• 申請（專利權）人: 上海益諾思生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N15/14
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明公開了食蟹猴淋巴細胞的流式圈門方法。該流式圈門方法利用CD45圈出所有淋巴細胞，最大程度圈出了所有的淋巴細胞，并保證了圈出淋巴細胞的純度；再利用CD4和CD8圈出CD4⁺和CD8⁺T淋巴細胞，盡可能圈出所有的CD4⁺T淋巴細胞和CD8⁺T淋巴細胞，同時保證了圈出的CD4⁺T淋巴細胞和CD8⁺T淋巴細胞的純度；本發明的流式圈門方法不會過度依賴技術人員的經驗，保證了檢測的一致性，使圈門方式更加合理、客觀。

技術領域

本發明屬于細胞流式檢測領域，具體涉及一種食蟹猴淋巴細胞的流式圈門方法。

背景技術

食蟹猴流式細胞學檢測在藥物臨床前安全評價中的主要作用是評價食蟹猴淋巴細胞功能的變化。目前常規的T淋巴細胞流式圈門方式是通過技術人員的經驗先圈出所有淋巴細胞(圖1)，再通過CD3/CD4/CD8抗體進行后續操作，技術人員的經驗決定了淋巴細胞圈門的質量。

CD45分子在所有白細胞上都有表達，稱為白細胞共同抗原(leukocyte commonantigen,LCA)，CD45由一類結構相似，分子量較大的跨膜蛋白組成，廣泛存在于白細胞表面，其胞漿區段具有蛋白質酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物P56lck和P59fyn上酪氨酸脫磷酸而激活，在細胞的信息傳導中發揮重要作用，CD45是細胞膜上信號傳導的關鍵分子，在淋巴細胞的發育成熟，功能調節及信號傳遞中具有重要意義。

目前最為常見的T淋巴細胞圈門方式是：利用流式細胞儀的前向光FSC和側向光SSC，將細胞分為大體分為中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞。技術人員依照經驗將淋巴細胞圈出后，再通過CD3/CD4/CD8等抗體的熒光進行后續操作。該圈門方式的弊端是門中圈出來的細胞為淋巴細胞，由于檢測人員的經驗不同，門內淋巴細胞的純度有區別。特別是當淋巴細胞豐度較低時，會照成淋巴細胞的丟失，對結果產生影響。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術中存在的淋巴細胞圈門時的收率低和主觀性導致的準確度低的缺陷，提供一種食蟹猴淋巴細胞的流式圈門方法，利用CD45分子圈出所有白細胞，再通過CD4和CD8圈出T淋巴細胞，最大程度保證T淋巴細胞被識別，改變了常規圈門方式過于依賴檢測人員的經驗，使檢測更加規范化，保證了試驗的質量。

為解決上述問題，本發明采取的技術方案為：一種食蟹猴淋巴細胞的流式圈門方法，包括步驟：通過側向光和CD45熒光檢測經CD45抗體孵育過的食蟹猴全血細胞，圈出食蟹猴全血中的淋巴細胞。

較佳地，所述流式圈門方法還包括用CD4熒光圈出經CD4抗體孵育過的食蟹猴全血中的CD4⁺T淋巴細胞。

較佳地，所述流式圈門方法還包括用CD8熒光圈出經CD8抗體孵育后的食蟹猴全血中的CD8⁺T淋巴細胞。

較佳地，所述孵育的時長為45min。

較佳地，所述流式圈門方法還包括在所述孵育后去除食蟹猴全血中的紅細胞。其中，所述除去食蟹猴全血中的紅細胞的方法優選用溶血劑孵育。

較佳地，用溶血劑孵育的時長為20min。

較佳地，所述流式圈門方法包括以下步驟：

1)將抗猴CD45抗體、CD4抗體和CD8抗體加入食蟹猴全血，避光孵育；

2)將溶血劑加入經步驟1)處理后的食蟹猴全血；

3)調整流式細胞儀各熒光通道電壓，使細胞明顯地分為5類，并將該電壓設置為模板；用流式細胞儀的側向光和CD45熒光檢測經步驟2)處理后的食蟹猴全血，圈出淋巴細胞；

4)用CD4和CD8的熒光圈出CD4⁺T淋巴細胞和CD8⁺T淋巴細胞。