[發明專利]一種橘色雙冠麗魚黃色素細胞分離和培養方法

在審

• 申請號: 201911337856.7
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN110951674A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 宋紅梅;周康奇;汪學杰;牟希東;劉奕;劉超;胡隱昌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

1.一種橘色雙冠麗魚黃色素細胞的構建方法，其特征在于，該方法為：將雙冠麗魚魚尾鰭、皮膚、鱗片放入胰蛋白酶中進行消化，收集細胞，再放入膠原酶溶液中進行消化，然后依次加入不同濃度percoll試劑，收集細胞進行原代培養和傳代培養即可獲得橘色雙冠麗魚黃色素細胞。

2.根據權利要求1所述的橘色雙冠麗魚黃色素細胞的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)組織消化：將雙冠麗魚魚尾鰭、皮膚、鱗片放入胰蛋白酶消化，收集細胞，再加入膠原酶溶液中消化，收集消化后的細胞；再依次加入55％percoll試劑、45％percoll試劑、35％percoll試劑，離心收集最上層細胞；

2)原代培養：將上步收集的細胞加入KC1細胞培養基制成細胞懸液，進行原代培養；

3)傳代培養：當原代培養細胞鋪滿培養瓶底80～90％時，去培養液，胰蛋白酶消化，消化后去酶液，加入KC培養基純化細胞，當細胞鋪滿培養瓶底80～90％時，加入MC2培養基將細胞重懸進行傳代培養。

3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述雙冠麗魚魚尾鰭、皮膚、鱗片為剪碎的魚尾鰭、皮膚、鱗片。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述胰蛋白酶消化溫度為25℃～28℃，消化時間為6～8h。

5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述膠原酶溶液含有牛血蛋白、膠原酶I、DNase I、以及大豆胰蛋白酶抑制劑。

6.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述膠原酶溶液消化溫度為25℃～28℃，化時間為12～15h。

7.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)依次加入的35％percoll試劑、45％percoll試劑、55％percoll試劑的體積為2～3mL。

8.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟2)所述KC1細胞培養基含有K-SFM培養基，10～11％胎牛血清，10～12ng/mL TPA，20～22ng/mL bFGF，1～2％雙抗。

9.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟3)所述KC培養基含有K-SFM培養基，5～8％胎牛血清，10～12ng/mL TPA；所述MC2培養基含有DMEM培養基，20～25％胎牛血清，1～2ng/mL TPA，20～22ng/mL bFGF，1～2％雙抗。

10.橘色雙冠麗魚黃色素細胞系在培養魚類色素細胞中的應用，其特征在于，所述橘色雙冠麗魚黃色素細胞系的構建方法為權利要求1～9任一所述的方法；所述魚類為橘色雙冠麗魚。