[發(fā)明專利]一種強(qiáng)啟動(dòng)子及其在產(chǎn)維生素B12

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911335790.8
• 申請(qǐng)日: 2019-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN111041029B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張大偉;董會(huì)娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/78;C12N15/74;C12N15/65;C12N1/21;C12P19/42;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發(fā)明通過(guò)擴(kuò)增黏著劍菌中的一種強(qiáng)啟動(dòng)子，進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證，獲得可廣泛用于苜蓿中華根瘤菌、脫氮假單胞菌和黏著劍菌等產(chǎn)維生素B₁₂菌種中進(jìn)行基因表達(dá)、遺傳基因操作和菌株改良的強(qiáng)啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。本發(fā)明還涉及含有該強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，利用該啟動(dòng)子構(gòu)建基因工程菌株的方法及相應(yīng)的菌株，及宿主細(xì)胞在啟動(dòng)目的基因表達(dá)的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種強(qiáng)啟動(dòng)子，尤其涉及從黏著劍菌中分離、克隆得到的強(qiáng)啟動(dòng)子，還涉及包含該強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒及含有該質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化子，以及他們?cè)诋愒椿蛲吹鞍妆磉_(dá)方面和在產(chǎn)維生素B₁₂菌株中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分可以被RNA聚合酶識(shí)別，并起始啟動(dòng)子后面基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子啟動(dòng)強(qiáng)度的強(qiáng)弱對(duì)基因操作中外源基因的表達(dá)效率有著直接的影響。代謝工程常常需要表達(dá)外源基因或者調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)，而啟動(dòng)子的選擇對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要。啟動(dòng)子影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響人工合成途徑或本源途徑中各基因間協(xié)調(diào)性，繼而影響菌株的代謝功能。

變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，根據(jù)16sRNA可以分為五個(gè)綱，分別為α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、δ-變形菌和ε-變形菌。其中α-變形菌中，包括很多動(dòng)物和植物致病菌，如：流產(chǎn)布魯氏菌、致瘤農(nóng)桿菌等，以及很多可以產(chǎn)生具有一定功能次級(jí)代謝產(chǎn)物的菌種，如可以產(chǎn)生物乙醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，可以產(chǎn)維生素B₁₂的脫氮假單胞菌、苜蓿中華根瘤菌和黏著劍菌等。為了進(jìn)一步研究產(chǎn)維生素B₁₂菌種的生理特征，以及擴(kuò)大相應(yīng)菌種產(chǎn)維生素B₁₂的能力，往往需要在菌體內(nèi)過(guò)量表達(dá)一個(gè)或多個(gè)基因，這時(shí)就需要一個(gè)高效的啟動(dòng)子原件作為基礎(chǔ)。然而，產(chǎn)維生素B₁₂菌種中可用的高效啟動(dòng)子數(shù)量非常有限。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究探索，發(fā)現(xiàn)了可以應(yīng)用于多種產(chǎn)維生素B₁₂菌種中的一種強(qiáng)啟動(dòng)子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：提供一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，包含該強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體及其在產(chǎn)維生素B₁₂菌株中的應(yīng)用。本發(fā)明以Ensifer adhaerens Casida A(黏著劍菌)為模板，擴(kuò)增獲得了一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子序列，以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行了評(píng)價(jià)。這個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子還可以應(yīng)用于黏著劍菌外的其他產(chǎn)維生素B₁₂菌種中。該發(fā)明擴(kuò)展了產(chǎn)維生素B₁₂菌種的啟動(dòng)子元件，對(duì)于產(chǎn)維生素B₁₂菌種中的基因表達(dá)、遺傳基因操作和菌株改良有重要意義。

第一方面，本發(fā)明提供了一種強(qiáng)啟動(dòng)子，其核苷酸序列任選自如下(a)、(b)或(c)所述的序列：

(a)強(qiáng)啟動(dòng)子為序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(b)與序列表SEQ ID NO:1具有75％以上一致性，且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；

(c)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)所述的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述(b)為與序列表SEQ ID NO:1具有95％以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。

第二方面，本發(fā)明提供了一種含有強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體為游離型或整合型載體。優(yōu)選地，所述游離型載體為含有革蘭氏陰性菌均可識(shí)別的復(fù)制子和mob基因的廣泛宿主穿梭質(zhì)粒載體，進(jìn)一步優(yōu)選pBBR1MCS2；所述整合型載體為攜帶有靶基因翼側(cè)500-4000 堿基同源重組臂的同源重組載體，進(jìn)一步優(yōu)選pUC系列質(zhì)粒。

所述質(zhì)粒載體還包括編碼目的多肽的核酸序列。所述編碼目的多肽的核酸序列包括熒光蛋白；優(yōu)選地，所述熒光蛋白為綠色熒光蛋白。