[發(fā)明專利]一種具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911282247.6
• 申請(qǐng)日: 2019-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110894224B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜明;李晗;王震宇;譚曉怡;吳超;夏小雨;喬昕昱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/435
• 分類號(hào): C07K14/435;C12N15/12;C12N15/70;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C12R1/19
• 代理公司: 大連格智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

本發(fā)明公開(kāi)了一種具有高熱穩(wěn)定性牡蠣鐵蛋白以及制備方法，上述牡蠣鐵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，將野生型牡蠣鐵蛋白第120位的天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔塑账嵊蒰cc突變?yōu)間ac。本發(fā)明方法為：以牡蠣為原料，重組表達(dá)牡蠣鐵蛋白，通過(guò)點(diǎn)突變將鐵蛋白三重軸處帶有負(fù)電荷的天冬氨酸突變?yōu)椴粠щ姷母拾彼幔?jīng)細(xì)胞超聲破碎、硫酸銨沉淀與弱陰離子交換柱層析獲得高純度的具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白。本發(fā)明使鐵蛋白熱穩(wěn)定性由76℃提高至87℃，同時(shí)仍具有一定的生理活性；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，條件可控性強(qiáng)，其最大優(yōu)勢(shì)在于可在相對(duì)較高的溫度條件下保持牡蠣鐵蛋白的生理活性并仍具有獨(dú)特的自組裝特性，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白以及基于基因工程手段制備的方法。

背景技術(shù)

鐵蛋白于1937年從脊椎動(dòng)物馬的脾臟中純化分離出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)鐵蛋白廣泛存在于脾臟、肝臟、腎臟、骨髓、心臟、胰腺、腸、胎盤等代謝活躍的組織及脊椎動(dòng)物的血液中，具有耐稀酸pH＝2、耐稀堿pH＝12和耐較高溫度70～75℃不變性等特性。鐵蛋白外形結(jié)構(gòu)呈球形，由蛋白殼和鐵核兩部分組成，前者是由24個(gè)亞基高度對(duì)稱性地組成的內(nèi)空腔結(jié)構(gòu)，而后者是由數(shù)千氫氧化鐵分子和數(shù)百磷酸鹽分子組成非均勻的鐵核結(jié)構(gòu)，并可劃分為高磷鐵比的鐵核表層和低磷鐵比鐵核內(nèi)層結(jié)構(gòu)。鐵蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子含量高時(shí)，鐵蛋白通過(guò)它的亞鐵氧化還原中心，在氧氣的協(xié)助下，將其催化氧化生成無(wú)毒的三價(jià)鐵儲(chǔ)藏在它的內(nèi)部，1分子鐵蛋白最多可儲(chǔ)存4500個(gè)三價(jià)鐵，這個(gè)特點(diǎn)是鐵蛋白與其它酶最大的不同之處。當(dāng)細(xì)胞需要鐵時(shí)，鐵蛋白在還原劑的幫助下，將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵離子從其內(nèi)部釋放出來(lái)，以供其它蛋白質(zhì)合成利用，所以鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)具有去除二價(jià)鐵離子的毒性以及調(diào)節(jié)鐵代謝平衡的雙重作用，具有重大的生物學(xué)活性。Durand等人研究證明可采用離子交換色譜法和高效液相色譜法從牡蠣內(nèi)臟中分離純化鐵蛋白。SDS-PAGE電泳上顯示一個(gè)20kDa的條帶。牡蠣鐵蛋白cDNA的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，它們與合浦珠母貝、靜水椎實(shí)螺和勃艮第蝸牛具有一致性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，負(fù)責(zé)氧化鐵酶中心的殘基存在于牡蠣鐵蛋白亞基中。

目前，由于天然純化所得鐵蛋白含量有限且價(jià)格昂貴，因此鐵蛋白無(wú)法大量適用于實(shí)驗(yàn)研究以及藥物開(kāi)發(fā)體系中。天然牡蠣鐵蛋白的熱變性溫度為76℃，雖具有相對(duì)較好的耐熱性，但隨著溫度進(jìn)一步升高，鐵蛋白的應(yīng)用仍有一定的限制。因此，基因原核表達(dá)不僅可以提高表達(dá)效率，并且價(jià)格相對(duì)低廉，適合大批量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白以及其制備方法。本發(fā)明通過(guò)改變野生型牡蠣鐵蛋白的氨基酸序列，從而改變牡蠣鐵蛋白的三重軸附近環(huán)境，從而提高牡蠣鐵蛋白的耐熱程度，擴(kuò)大鐵蛋白的應(yīng)用范圍。本發(fā)明首次對(duì)野生型牡蠣鐵蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變，增加其耐熱能力，具有較高的實(shí)際意義和應(yīng)用前景。可用于貯藏鐵以供人類需要或作為載體傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等領(lǐng)域。

本發(fā)明通過(guò)點(diǎn)突變改變野生型牡蠣鐵蛋白的氨基酸序列，構(gòu)建一種新的鐵蛋白。所述的野生型牡蠣鐵蛋白氨基酸序列由NCBI網(wǎng)站提供(Gene ID：LOC105327516)，將所述野生型牡蠣鐵蛋白氨基酸序列中第120位的天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔塑账嵊蒰cc突變?yōu)間ac，獲得一種具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白。鐵蛋白由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，可裝載小分子物質(zhì)或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此可以作為一種運(yùn)輸載體傳輸機(jī)體所需物質(zhì)。成功獲得此蛋白可以擴(kuò)大鐵蛋白的使用范圍。

一種具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，分子量為480kDa；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。

編碼所述具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白的基因mGF1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種上述具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白的制備方法，包括步驟：

S1、獲得編碼上述具有高熱穩(wěn)定性的牡蠣鐵蛋白核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；