[發(fā)明專利]Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911254039.5
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113025648B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 霍永庭;涂晶晶;秦學(xué)芳;符俊;翁源燦
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東菲鵬制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 李雙艷

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，提供了一種Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法，培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA后的Expi293細(xì)胞的步驟包括降溫處理。通過采用該操作能將目標(biāo)蛋白的表達(dá)量和活性大幅度提高，克服了現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)染效率低和表達(dá)量低的缺點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

生產(chǎn)高達(dá)毫克或克級的重組蛋白是許多科研團(tuán)隊和制藥公司臨床前、生化、生物物理和藥物研究的基本過程。目前，已經(jīng)存在多種可以生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)體系，包括大腸桿菌表達(dá)體系、真核酵母表達(dá)體系、桿狀病毒介導(dǎo)昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系和哺乳動物表達(dá)體系。大腸桿菌表達(dá)體系操作簡單，培養(yǎng)成本低，并且能夠快速產(chǎn)生高水平的重組蛋白，但存在重組蛋白溶解性差或缺乏適當(dāng)?shù)姆g后修飾的問題。真核酵母表達(dá)體系，特別是Pichiapastoris和Saccharomyces?cerevisiae，提供了原核宿主(例如大腸桿菌宿主)的替代品和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一些能力，然而，由于技術(shù)要求，酵母表達(dá)體系在許多實驗室中并不流行。桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系具有真核蛋白質(zhì)合成能力，并提供類似于哺乳動物細(xì)胞中觀察到的蛋白質(zhì)折疊、修飾和加工，然后，桿狀病毒介導(dǎo)昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系的主要缺陷是需要花費大量時間和精力去表達(dá)目標(biāo)蛋白，而且昆蟲細(xì)胞的蛋白質(zhì)N-糖基化途徑不能產(chǎn)生具有倒數(shù)第二個半乳糖和末端唾液酸殘基的復(fù)雜的二元N-連接的寡糖側(cè)鏈。與上述三個體系相比，哺乳動物細(xì)胞體系生產(chǎn)重組蛋白由于其具有能最佳的表達(dá)高分子量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物、使復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白產(chǎn)生正確的折疊和給糖蛋白提供合適的翻譯后修飾的功能而成為生物制藥領(lǐng)域的表達(dá)重組蛋白的最佳選擇。

傳統(tǒng)的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系是構(gòu)建細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的將外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定株表達(dá)體系。構(gòu)建穩(wěn)定株表達(dá)體系生產(chǎn)重組蛋白需要在DNA導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行長時間的篩選，然后才能確定表達(dá)量高并且穩(wěn)定的細(xì)胞株，這個過程通常需要幾個月的時間并且花費大量的人力來完成。

隨著生命科學(xué)和生物制藥的飛速發(fā)展，大量的蛋白被用于基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)，急需一個能在短時間內(nèi)就能得到重組蛋白的方法。基因瞬時表達(dá)應(yīng)運而生，與穩(wěn)定株表達(dá)體系不同，瞬時轉(zhuǎn)染的外源DNA不整合到宿主細(xì)胞DNA中，其在細(xì)胞中的數(shù)目通常隨著細(xì)胞的分裂而減少，因此蛋白表達(dá)只能維持幾天到十幾天的時間，但其優(yōu)點是能在短短幾天之內(nèi)拿到基因的表達(dá)產(chǎn)物，而且其通用性強(qiáng)。然而，相對于構(gòu)建穩(wěn)定株表達(dá)體系來說，瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)重組蛋白存在轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)量低的缺點，使得此方法的應(yīng)用受到較大的限制，此外，雖然轉(zhuǎn)染試劑與培養(yǎng)方法等逐漸成熟，然而瞬時轉(zhuǎn)染的成本也較高。因此怎樣提高瞬時轉(zhuǎn)染的效率、提高表達(dá)量并且降低瞬時轉(zhuǎn)染的成本使之成為日常操作成為亟待解決的問題。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法，以緩解上述技術(shù)問題中的至少一個，具體包括緩解現(xiàn)有技術(shù)中Expi293細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)目標(biāo)蛋白成本過高的問題。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述方法在免疫檢測中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種Expi293細(xì)胞瞬時表達(dá)目標(biāo)蛋白的方法，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA后的Expi293細(xì)胞，培養(yǎng)步驟包括降溫處理。

進(jìn)一步地，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA后的Expi293細(xì)胞的步驟包括：先36-38℃進(jìn)行培養(yǎng)，第1-3天再降溫至32-34℃培養(yǎng)到第4-10天。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)步驟還包括更換培養(yǎng)基重懸處理；

優(yōu)選地，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染目標(biāo)DNA后的Expi293細(xì)胞的步驟包括：先36-38℃進(jìn)行培養(yǎng)，第1-3天再降溫至30-34℃培養(yǎng)，第3-5天更換培養(yǎng)基，重懸培養(yǎng)至第6-10天；