[發明專利]狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遺傳系統的建立

在審

• 申請號: 201911253485.4
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113025630A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 薛向紅;卜研;閆喜軍;趙傳芳;趙建軍;陳杰;廉士珍;胡博
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12N15/45
• 分類號: C12N15/45;C12N7/01;C12N15/85
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，其特征在于，所述的感染性cDNA克隆是通過反向遺傳操作獲得的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種獲得權利要求1所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取HBF-1病毒懸液的總RNA；

(2)對獲得的RNA進行反轉錄，獲得cDNA。

(3)利用四對引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因組RNA的反轉錄產物cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶將HBF-1分4段進行擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小正確后進行凝膠回收；

F1 5’-GCGGCCGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAGACAAAGTTGGCTAAG-3’

R1 5’-GCGTACGTGAAAGCAGTTTTGAGCCT-3’

F2 5’-CTGCTTTCACGTACGCTTAAAAGCAATTATAAAAAACTTAGG-3’

R2 5’-GTTTAAACGCTTTTGAAGGAAATTAGGCGGGACT-3’

F3 5’-TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG-3’

R3 5’-GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA-3’

F4 5’-GGGATGATGACCGTGTTAATTAATCCCTTACCGATGATTGAATT-3’R4 5’-CGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAGACAAAGCTGGGTATGATAAC-3’

(4)真核表達載體pcDNA3.1的改造

對真核表達載體pcDNA3.1的多克隆酶切位點進行改造，將制備的帶有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位點、部分丁型肝炎核酶的序列連接到通過PmeⅠ酶切過后的pcDNA3.1載體上，將改造后的載體命名為pcDNA3.2；

(5)將F1、F2、F3、F4片段分別連接至pEASY-Blunt，測序，將測序正確的各基因片段分別依次連接到改造后的載體pcDNA3.2的CMV啟動子下游，獲得含有權利要求1所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的質粒。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)獲得的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，步驟(4)中帶有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位點、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.權利要求1所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆在拯救重組狐源犬瘟熱病毒強毒rHBF-1株中的應用。

5.一種狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的反向遺傳操作系統，其特征在于，所述的操作系統由含有權利要求1所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重組質粒和表達狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三個輔助質粒組成。

6.如權利要求5所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的反向遺傳操作系統，其特征在于，編碼所述的狐源犬瘟熱病毒強毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分別如SEQID NO.4-6所示。