[發明專利]體內細胞增殖標記與示蹤系統及其應用

有效

• 申請號: 201911242892.5
• 申請日: 2019-12-06
• 公開（公告）號: CN112921052B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 周斌;劉秀秀;何靈娟;蒲文娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子細胞科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶啟長;韋東

1.一種重組酶系統，其特征在于，

所述系統包含

(1)核酸分子，其從5’端到3’端依次包含5’同源臂、第一重組酶的編碼序列、第二重組酶的識別位點、雌激素受體ER編碼序列、第二重組酶的識別位點和3’同源臂，所述5’同源臂和3’同源臂能將二者之間的序列重組到基因組中，使得二者之間的序列與基因組中的細胞增殖因子基因共表達，和

(2)編碼從N端到C端依次包含第二重組酶和雌激素受體ER的融合蛋白的核酸分子，

(3)包含以下結構的核酸分子：從5’端到3’端分別是第一重組酶的識別位點、終止序列、第一重組酶的識別位點和標記物編碼序列，或

所述系統包含

(a)含有核酸分子的第一核酸構建物，所述核酸分子從5’端到3’端依次包含5’同源臂、第一重組酶的編碼序列、第二重組酶的識別位點、雌激素受體ER編碼序列、第二重組酶的識別位點和3’同源臂，所述5’同源臂和3’同源臂能將二者之間的序列重組到基因組中，使得二者之間的序列與基因組中的細胞增殖因子基因共表達，和

(b)第二核酸構建物，具有編碼從N端到C端依次包含第二重組酶和雌激素受體ER的融合蛋白的多核苷酸序列，

(c)第三核酸構建物，具有包含以下結構的多核苷酸序列：從5’端到3’端分別是第一重組酶的識別位點、終止序列、第一重組酶的識別位點和標記物編碼序列，

所述第一重組酶和第二重組酶分別是Cre和Dre或Dre和Cre，其中，Cre的識別位點是LoxP，Dre的識別位點是rox。

2.如權利要求1所述的重組酶系統，其特征在于，(1)和(a)中所述5’同源臂和3’同源臂能將二者之間的序列重組到所述細胞增殖因子基因的5’或3’端，(1)或(a)所述核酸分子具有選自以下的一個或多個特征：

所述細胞增殖因子是Ki67或PCNA，

所述5’同源臂的核酸序列如SEQ?ID?NO:1第1-3000位核苷酸所示，

所述3’同源臂的核酸序列如SEQ?ID?NO:1第5128-8127位核苷酸所示，

Dre的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2的第1-356位氨基酸所示，

Cre的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，

LoxP的核酸序列如SEQ?ID?NO:4所示，

rox的核酸序列如SEQ?ID?NO:5所示，

雌激素受體ER的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2的第357-666位氨基酸所示。

3.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1或2所述的系統。

4.一種構建轉基因動物的方法，包括：

將三種F₀代動物中的任兩種交配，然后將發生同源重組的F₁代動物與第三種F₀代動物交配，在F₂代動物中發生同源重組從而獲得包含第一、第二和第三多核苷酸序列的轉基因動物，

其中，

F₀代第一動物的基因組中含有第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列從5’端到3’端依次包含5’同源臂、第一重組酶編碼序列、第二重組酶的識別位點、雌激素受體ER編碼序列、第二重組酶的識別位點和3’同源臂，并且所述第一多核苷酸序列與基因組中的細胞增殖因子基因共表達；

F₀代第二動物的基因組中含有第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列編碼從N端到C端依次包含第二重組酶和雌激素受體ER的融合蛋白，

F₀代第三動物的基因組中含有第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列從5’端到3’端依次是第一重組酶的識別位點、終止序列、第一重組酶的識別位點和標記物編碼序列。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述動物是小鼠。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一、第二重組酶，雌激素受體ER和細胞增殖因子如權利要求1或2中所記載。