[發明專利]一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201911231718.0
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN111172103A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 吳金蕓;徐文倩;葉華衍;張炬;雷登
• 申請（專利權）人: 伯仕利生物科技發展（鹽城）有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P9/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)間充質干細胞的制備；

2)將步驟1)得到的間充質干細胞接種于培養皿中，無血清培養；

3)在培養基中加入當歸提取物，繼續培養并收集細胞培養上清液；

4)超速離心，得到所述干細胞外泌體。

2.根據權利要求1所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)間充質干細胞的制備；

2)取步驟1)制備的間充質干細胞，用0.25％胰蛋白酶進行常規消化、收集細胞懸液；

3)用血球計數板進行計數，再按照1×10⁵個細胞/孔接種于6孔板中，在溫度為37℃、濕度為95％、5％CO₂條件下培養24h，去除上清；

4)更換含有當歸提取物的opti-MEM培養基，繼續培養3天，并收集細胞培養上清液；

5)超速離心，得到所述干細胞外泌體。

3.根據權利要求2所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：所述步驟5)中，包括以下步驟：

A.取步驟4)收集的細胞培養上清液，在4℃、350g下離心15分鐘，得到一次離心上清液；

B.取步驟A得到的一次離心上清液，在4℃、7000g下離心10分鐘，得到二次離心上清液；

C.取步驟B得到的二次離心上清液，在4℃、20000g下離心20分鐘，得到三次離心上清液，再將三次離心上清液經0.22μM孔徑濾膜過濾，得到濾液；

D.取步驟C得到的濾液，在4℃、130000g下離心1.5h，取沉淀物，加入pH為7.4的PBS緩沖液復溶，得到所述干細胞外泌體。

4.根據權利要求2所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：步驟4)中，所述當歸提取物的制備步驟為：取當歸粉末，通過水提法進行提取得到提取液，過濾除去沉淀，濃縮凍干。

5.根據權利要求4所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：步驟4)中，水提法提取當歸粉末時，提取時間為1-3h，提取次數為1-3次，當歸粉末與水的重量比為1：10。

6.根據權利要求2所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：所述當歸提取物的濃度為1g/mL。

7.根據權利要求2所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述間充質干細胞來源于骨髓、臍帶或子宮內膜。

8.根據權利要求7所述的一種當歸提取物刺激的干細胞外泌體的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述間充質干細胞的制備方法包括以下步驟：

a)無菌條件下取近胎兒端臍帶20cm，兩端各剪去2cm，先用含200U青鏈霉素的生理鹽水漂洗臍帶4-5次，至無血跡，再用無雙抗的生理鹽水漂洗，放含少許DMEM/F12培養基的培養皿中，剪成2-3cm的小段，將小段縱向剪開，剔除臍帶內動、靜脈血管，用組織鑷將組織塊撕成細條狀，放入含少量DMEM/F12培養基的培養皿中，用眼科剪剪成1-2mm³的組織塊，整個過程在冰浴中進行；

b)將剪碎的組織塊蘸上少許血清，移入透氣T25培養瓶中，每瓶20個，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培養基，培養48h后換液，待有細胞貼壁后更換培養基，培養約8-12天，去除組織塊；培養約20天，細胞長至80％融合，經胰酶消化收集細胞，得到間充質干細胞。

9.按權利要求1-8中任意一項所述的干細胞外泌體在治療血管損傷的修復藥物中的用途。