[發明專利]一種用于檢測人臍帶間充質干細胞表面分子標記方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201911230423.1
• 申請日: 2019-12-04
• 公開（公告）號: CN110760572A
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 薛松磊;沈暉;崔恒宓
• 申請（專利權）人: 江蘇易諾維生物醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于檢測人臍帶間充質干細胞表面分子標記方法和試劑盒，包括以下步驟：1)收集、分離培養人臍帶間充質干細胞；2)將上述人臍帶間充質細胞培養至對數生長期，使用重組胰酶消化2?3min后收集至EP管中；3)使用試劑盒提供總RNA，合成cDNA；4)根據CD105、CD90、CD73、CD19、CD34、CD45、CD116和HLA?DR的基因設計引物序列，并以上述cDNA為模板進行PCR擴增；5)通過全自動核酸分析系統對步驟4)得到的PCR產物進行定性定量檢測。本發明選用三種陽性表面分子標記CD105、CD90、CD73和五種陰性表面分子標記CD19、CD34、CD45、CD116、HLA?DR來快速檢測人間充質干細胞的表面分子標記，從而確定培養的干細胞的質量。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種用于檢測人臍帶間充質干細胞表面分子標記方法。

背景技術

間充質干細胞是一類具有表面特異性標記的細胞，國際間充質干細胞委員會于2006年制定的最低鑒定標準中就包括標記物的鑒定，傳統的檢測方法通過流式細胞技術進行檢測，這種方法檢測效果較好，但是存在著檢測周期長、檢測樣本要求高、抗體訂購周期長和價格高、流式細胞儀昂貴等問題，小規模實驗室難以承受這些試劑和耗材的支出。

人臍帶間充質干細胞(hMSCs-UC)是一類具有多項分化潛能的胎兒來源的間充質干細胞，大量的研究發現間充質干細胞具有向內、中、外3個胚層，包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肝細胞、心肌細胞等分化發育的潛能。在各種間充質干細胞中，人臍帶間充質干細胞來源于孕婦產后醫療廢棄物，具有樣本來源豐富、對供者無影響、同時也易于采集和運輸、無明顯的異體排斥反應、且無倫理爭議等諸多優點。

因此，以人臍帶間充質干細胞為研究對象研究一種可快速檢測干細胞的表面分子標記的方法具有重要意義。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種用于檢測人臍帶間充質干細胞表面分子標記方法和試劑盒，本方法選用三種陽性表面分子標記CD105、CD90、CD73和五種陰性表面分子標記CD19、CD34、CD45、CD116、HLA-DR來快速檢測人間充質干細胞的表面分子標記，從而確定培養的干細胞的質量，為間充質干細胞的實驗研究以及應用提供評價標準。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：一種用于檢測人臍帶間充質干細胞表面分子標記方法，包括以下步驟：

1)收集、分離培養人臍帶間充質干細胞；

2)將上述人臍帶間充質干細胞培養至對數生長期，使用重組胰酶消化2-3min后收集至EP管中；

3)使用試劑盒提供總RNA，合成cDNA；

4)根據CD105、CD90、CD73、CD19、CD34、CD45、CD116和HLA-DR的基因設計引物序列，并以上述cDNA為模板進行PCR擴增；

5)通過全自動核酸分析系統對步驟4)得到的PCR產物進行定性定量檢測。

進一步地說，所述步驟4)中各基因的引物序列為：

所述CD105的引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述CD90的引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述CD73的引物序列為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

所述CD19的引物序列為SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

所述CD34的引物序列為SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；

所述CD45的引物序列為SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；