[發明專利]對輔酶親和力提高的葡萄糖脫氫酶突變體

有效

• 申請號: 201911196603.2
• 申請日: 2019-11-29
• 公開（公告）號: CN112877305B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 朱傅赟;沈青;陶榮盛;鄭云;孫梁棟;沈正權;潘震華;原犇犇;胡海亮;劉萍
• 申請（專利權）人: 湖州頤輝生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12P7/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明公開了一種對輔酶親和力提高的葡萄糖脫氫酶突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5，與初始型葡萄糖脫氫酶SEQ ID NO:1相比，提高了對于NAD+和NADP+的親和力，同時保持了熱穩定性，可用于生物催化的不對稱還原反應。

技術領域

本發明屬于酶催化技術領域，具體地說，涉及一種對輔酶親和力提高的葡萄糖脫氫酶突變體。

背景技術

生物不對稱還原反應是生物催化法生產手性化合物中常見的生物催化反應，與酶拆分最高50％的收率相比，不對稱還原反應最高可以達到100％，所以在催化合成手性醇、羥基酸、氨基酸等手性化合物方面具有廣泛應用。

有葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH)參與的生物不對稱還原反應比如羰基還原反應大多都需要輔酶NAD(P)H/NAD(P)+，NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶I)和NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，輔酶II)的作用是，作為氧化劑掠奪電子，葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖氧化，同時將NADP+還原為NADPH，產生充足的NADPH作為生物合成的還原劑，從而促進還原反應。

然而商品化的輔酶價格昂貴，因此在生物催化產業中氧化還原體系普遍存在輔酶再生的問題。輔酶的再生可以采用化學、光化學、酶學和電化學等再生系統，其中酶法再生系統由于具有反應速率快、再生體系與合成體系兼容性好、國外大企業已經將該技術廣泛應用于工業生產，如巴斯夫、德固賽和鐘淵化工等。

在目前工業生產采用的輔酶再生體系中，葡萄糖脫氫酶/葡萄糖體系對NADH/NADPH再生有很好的效果。Vázquez-Figueroa等(Vázquez-Figueroa,E.；Chaparro-Riggers,J.；Bommarius,A.S.(2007).Development of a thermostable glucosedehydrogenase by a structure-guided consensus concept.ChemBioChem,8(18),2295-2301.)對Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168來源的葡萄糖脫氫酶進行了熱穩定性改造，得到的Q252L/E170R突變體大大提高了在65℃的半衰期，同時提高了50％的比酶活。我們在專利申請CN201810343484.8中也描述了該葡萄糖脫氫酶突變體GDH/Q252L/E170R的構建方法。但GDH/Q252L/E170R對NAD+的依賴性高于NADP+，而NADP+比NAD+更加昂貴，在一些依賴NADP+的酶促反應中，GDH/Q252L/E170R的催化效率仍不能滿足工業化大生產的需求。

發明內容

為克服這一瓶頸，我們繼續以葡萄糖脫氫酶GDH/Q252L/E170R作為初始酶(本文中的序列SEQ ID NO:1)進行了研究，通過分子定向進化技術發現了2個新關鍵位點N46和L19，這兩個位點的改造可提高GDH對NAD+/NADP+的親和力，同時具有較高的熱穩定性。這意味著可以在催化反應中添加更少量的輔酶NAD+或NADP+即可實現氧化還原反應的高效運行，進一步降低了生產成本，因此具有極高的工業應用價值。

基于該研究發現，本發明提供如下技術方案：

一種葡萄糖脫氫酶突變體，其氨基酸序列為：

SEQ ID NO:3，其為SEQ ID NO:1第46位的天冬酰胺N替換為色氨酸W的突變體，氨基酸序列為：