[發明專利]一種過表達羥酸還原異構酶的葡萄汁酵母菌株及其應用

在審

• 申請號: 201911192978.1
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN110819547A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 張翠英;李憑;李彤;肖冬光;于愛群;郭學武;陳葉福;董健;林良才
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/54;C12G1/022;C12R1/85
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 艾變開;劉玉玲

本發明提供了一株過表達羥酸還原異構酶的葡萄汁酵母菌株及其應用，該葡萄汁酵母菌株可降低雙乙酰的含量，聯合過表達二羥異戊酸脫水酶或者部分敲除編碼的α?乙酰乳酸合成酶的ILV2基因后，可以進一步降低雙乙酰的含量，同時可降低高級醇的含量。利用該菌株發酵，提高了葡萄酒的風味質量，可釀造出風味優良且更有利于健康的葡萄酒。

技術領域：

本發明屬于生物工程和基因工程技術領域，涉及工業微生物的育種及其應用，具體是涉及一種低產雙乙酰、過表達羥酸還原異構酶的葡萄汁酵母菌株及其在制備葡萄酒中的應用。

背景技術：

葡萄酒是世界上最古老的具有濃厚文化底蘊的綠色保健飲料，也是現代生活中不可或缺的飲品。葡萄酒中的香氣成分復雜多樣，相對含量從每升幾納克到幾百毫克不等，在葡萄酒的呈香過程中起到重要作用。雙乙酰是葡萄酒中重要的風味物質，適量的雙乙酰，會增加葡萄酒的香氣，改善葡萄酒的風味，而當雙乙酰含量過高時，就可能產生令人生厭的“餿飯味”，葡萄酒表現變質跡象。因此，葡萄酒中的雙乙酰的含量必須控制在合適的范圍內。

目前對于雙乙酰調控的研究主要集中在啤酒發酵過程中。劉光誠等人發明了七日釀酒法，即在糖化和發酵過程中加入具有超強的電子還原性和離子交換功能的隕水速成劑，大幅降低了雙乙酰指標，改善啤酒的品質(中國專利，CN107619733A，2018-01-23)。趙云財等人制作一種富含α-氨基氮的啤酒專用麥芽糖漿，并用該麥芽糖漿作輔料生產啤酒，可以大幅度降低雙乙酰含量，提高啤酒的非生物穩定性(中國專利，CN103571672A，2014-02-12)。李紅等人采用含有適當濃度D-纈氨酸的13°P麥汁在適當條件下馴化酵母，從酵母泥中篩選出對D-Val敏感的菌株并進行發酵實驗，檢測敏感菌株雙乙酰含量，其降低率可達到34.08％(中國專利，CN104877922A，2015-09-02)。但上述工藝和菌株主要用于啤酒上，并未將其應用于葡萄酒，而且菌株通過篩選突變而來，重復性差。

基因ILV5編碼羥酸還原異構酶，是支鏈氨基酸代謝合成途徑的相關蛋白，目前對它的研究主要集中在該基因對高級醇的影響，大部分研究認為羥酸還原異構酶會提高高級醇中的含量(低產高級醇釀酒酵母突變菌株的差異蛋白組分析及高級醇合成相關蛋白的差異表達，王國正等，食品與發酵工業，2003-02-28)。也觀察到羥酸還原異構酶對聯二酮的前驅體物質的影響，經該酶作用后啤酒的風味和發酵度都很好(通過啤酒酵母控制聯二酮含量ILV5型基因和ILV3型基因的擴增對聯二酮含量和ILV酶活性的影響，祁明霞等，啤酒科技，2002-07-15)。然而這些基因對雙乙酰，尤其是葡萄酒中的雙乙酰的影響未見報道。

在釀酒過程中釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是傳統普遍應用的酵母菌種，但研究發現，在現代葡萄酒發酵中的非釀酒酵母數量較高(每毫升10⁶-10⁸個細胞數量)且持續存在，其與釀酒酵母一樣在產生酒精的同時對葡萄酒的風味和香氣等感官特征有著重要的影響，這導致人們又重新看待這些酵母在釀酒中的作用。隨著分子生物學技術的發展，利用基因工程改造非釀酒酵母獲得具有新的理想特征的各種酵母菌種，釀造具有復雜口感、風格獨特的葡萄酒將會成為現代葡萄酒產業發展的重要方向。

發明內容：

本申請發現，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)是一種具有潛在的釀酒特性的非釀酒酵母，其在高產甘油和低產乙醇的同時，也能比釀酒酵母產生更多的芳香物質。利用分子育種技術構建調控雙乙酰葡萄汁酵母工業菌株，對提高葡萄酒的風味質量具有重要意義。因此，

本發明的第一方面，提供一種低產雙乙酰的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株，所述菌株過表達羥酸還原異構酶。

優選的，所述菌株還部分敲除編碼α-乙酰乳酸合成酶的ILV2基因，優選的，所述菌株還低產高級醇。

更優選的，所述菌株還過表達二羥異戊酸脫水酶。