[發明專利]一種高效生產2’-巖藻糖基乳糖的重組菌的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201911188891.7
• 申請日: 2019-11-28
• 公開（公告）號: CN110804577B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 沐萬孟;張文立;李雯;朱鶯鶯;萬李
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P19/18;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明提供了一種生產2’?巖藻糖基乳糖的大腸桿菌工程菌株，通過CRISPR/Cas9基因編輯系統，敲除原始菌株2’?巖藻糖基乳糖合成代謝途徑中的相關基因；構建模塊化代謝通路，通過不同質粒組合調控代謝途徑中的磷酸甘露糖變位酶(ManB)，甘露糖?1?磷酸鳥嘌呤基轉移酶(ManC)，GDP?甘露糖?6?脫氫酶(Gmd)，GDP?巖藻糖合成酶(WcaG)，L?巖藻糖1?激酶/GDP?巖藻糖焦磷酸化酶(Fkp)以及2’?巖藻糖基乳糖合成酶(FucT2)的表達水平，使細胞內能積累更高濃度的2’?巖藻糖基乳糖。本發明還提供了一種高效生產2’?巖藻糖基乳糖的方法。

技術領域

本發明涉及一種高效生產2’-巖藻糖基乳糖的重組菌的構建方法及其應用，屬于微生物基因工程領域。

背景技術

母乳通常被認為是提供嬰兒營養的最重要的來源。作為母乳中的含量第三的固體組分，對于嬰幼兒腸道菌群的發育以及預防病原菌與上皮細胞的粘附，人乳寡糖的合成發揮著重要的作用。巖藻糖基化乳糖，包括2’-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、乳酰-N-巖藻五糖等，能選擇性地刺激雙歧桿菌的生長并形成致病菌受體的類似物，從而保護嬰兒防止腸道病原體的感染，如腸道病原體，大腸桿菌、霍亂弧菌和沙門氏菌。2’-巖藻糖基乳糖作為人乳寡糖中含量最高的成分，受到廣泛關注，具備應用于嬰幼兒產品的廣泛前景。

相比于酶法和化學法，以微生物發酵法合成2’-巖藻糖基乳糖更加高效和安全。目前微生物發酵法發酵法生產2’-巖藻糖基乳糖主要有兩個代謝通路，分別是從頭合成途徑和補救途徑。從頭合成途徑主要是通過將磷酸甘露糖變位酶（ManB），甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶（ManC），GDP-甘露糖-6-脫氫酶（Gmd）,GDP-巖藻糖合成酶（WcaG）中的一個或多個基因在大腸桿菌中過表達，或者通過補救合成途徑，過表達L-巖藻糖1-激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶（Fkp）和2’-巖藻糖基乳糖合成酶（FucT2）；Lee等將從頭合成途徑的ManB、ManC、Gmd、WcaG以及FucT2共表達于失去β-半乳糖糖苷酶活性的E. coli JM109，提高了乳糖利用率，2’-巖藻糖基乳糖的搖瓶發酵產量最終達到了1.25g/L。但E.coli JM109菌株在發酵過程中形成的生物膜可帶來很多嚴重的后果，難以應用于高密度發酵。還有報道通過基因整合的方式將GDP-巖藻糖從頭合成途徑的關鍵基因以及FucT2整合到E.coli JM109染色體組上，避免了抗生素的食品安全問題，在無抗生素的13L補料發酵中，得到了20.28 g/L的產量。但相對與傳統的質粒表達，基因整合的過程較為復雜，基因的表達水平較低。

此外，Chin等構建了2’-巖藻糖基乳糖生產的補救途徑，敲除大腸桿菌中代謝乳糖的lacZ基因，2’-巖藻糖基乳糖的產率提高了4.3倍；同時又敲除代謝巖藻糖的fucIK基因簇，使2’-巖藻糖基乳糖的產量得到進一步提高，搖瓶發酵產量達到2.1g/L。盡管2’-巖藻糖基乳糖的產量得到顯著提高，但用于其生產的L-巖藻糖價格昂貴, 2’-巖藻糖基乳糖的產率也較低（67.7％），較難應用于大規模的發酵生產。

發明內容

針對現有的技術難點及存在的問題，本發明提供了一種高效生產2’-巖藻糖基乳糖的大腸桿菌工程菌及其構建方法。

本發明的第一個目的是提供一種高效生產2’-巖藻糖基乳糖的大腸桿菌工程菌，所述大腸桿菌工程菌組合調控磷酸甘露糖變位酶ManB，甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶ManC，GDP-甘露糖-6-脫氫酶Gmd，GDP-巖藻糖合成酶WcaG、L-巖藻糖1-激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶Fkp以及2-巖藻糖基乳糖合成酶FucT2的表達。

在本發明的一種實施例中，所述大腸桿菌工程菌還敲除了β-半乳糖苷酶LacZ、UDP-葡萄糖脂質載體轉移酶WcaJ、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶FucI-FucK基因簇。