[發明專利]酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白、合成方法及其應用

在審

• 申請號: 201911135958.0
• 申請日: 2019-11-19
• 公開（公告）號: CN110964099A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 錢松;張永正
• 申請（專利權）人: 江蘇悅智生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/81;A61L15/28;A61L15/32;A61L26/00;A61L27/20;A61L27/24;A61L27/54;A61K8/34;A61K8/44;A61K8/49;A61K8/63;A61K8/64;A61K8/65
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 張文杰

1.一種酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白，其特征在于：所述重組人源I型膠原α1鏈蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重組人源I型膠原α1鏈蛋白包括N端的Strep-TagII序列、人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽序列和C端的6×His序列，使其含有雙特異性親和純化標記；全長為1071個氨基酸。

2.根據權利要求1所述的酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白，其特征在于：所述重組人源I型膠原α1鏈蛋白的基因表達序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求2所述的酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白，其特征在于：所述人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的基因序列是經利用宿主慣用密碼子將天然膠原蛋白基因序列優化后得到的，基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一種酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)合成人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的基因序列；

2)制備含有Strep-TagII編碼序列的改造質粒pPIC9ks；

3)雙酶切改造質粒pPIC9ks，構建含有重組人源I型膠原α1鏈蛋白基因的重組質粒pPIC9k-colIα1；

4)將重組質粒pPIC9k-colIα1用限制性內切酶SalⅠ線性化，并將其電轉化入畢赤酵母SMD1168感受態細胞中，以營養缺陷型標記和G418抗性標記篩選高拷貝陽性重組子，得到畢赤酵母基因工程菌；

5)畢赤酵母基因工程菌的發酵培養；

6)發酵結束后，離心純化，得到所述重組人源I型膠原α1鏈蛋白。

5.根據權利要求4所述的酵母重組人源I型膠原α1鏈蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)合成人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的基因序列：在人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的氨基酸序列不變條件下，將人I型膠原α1鏈基因序列中對應的畢赤酵母不常用的密碼子優化為畢赤酵母偏愛性密碼子；再通過全基因合成人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的基因序列；

2)制備含有Strep-TagII編碼序列的改造質粒pPIC9ks；

a)首先以pPIC9k質粒為模板，利用引物P1、P2進行PCR擴增，產物長度為394bp；其中P1的基因序列如SEQ ID NO.4所示，P2的基因序列如SEQ ID NO.5所示；

b)對獲得的PCR產物和pPIC9k質粒分別做EcoRI和BamHI雙酶切，并經T4 DNA連接酶作用下，16℃連接過夜，得到改造質粒pPIC9ks；

3)構建含有重組人源I型膠原α1鏈蛋白基因的重組質粒pPIC9k-colIα1：

a)以步驟1)中合成的人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽的基因序列為模板，利用引物P3、P4進行PCR擴增，得到長度為3194bp的基因片段；其中P3的基因序列如SEQ ID NO.6所示，P4的基因序列如SEQ ID NO.7所示；

b)對步驟2)中得到的改造質粒pPIC9ks做ApaI和NotI雙酶切，獲得載體片段；

c)以P5、P6為引物，以自身為模板，通過PCR相互擴增，得到含有6×His編碼序列的基因片段，長度為65bp；其中P5的基因序列如SEQ ID NO.8所示，P6的基因序列如SEQ ID NO.9所示；

d)將步驟a)、步驟b)、步驟c)中的各片段混合，利用即用型無縫克隆試劑盒連接，50℃連接1h，得到含有Strep-TagII編碼序列、人源I型膠原蛋白α1鏈成熟肽基因序列、6×His編碼序列的重組質粒pPIC9k-colIα1；

4)將重組質粒pPIC9k-colIα1用限制性內切酶SalⅠ于37℃線性化，并將其電轉化入畢赤酵母SMD1168感受態細胞中，以組氨酸缺陷型標記和G418抗性標記篩選高拷貝陽性重組子，得到畢赤酵母基因工程菌；

5)畢赤酵母基因工程菌的發酵培養：將步驟4)中制備的畢赤酵母基因工程菌接種于YPD液體培養基中，30℃、220rpm過夜活化培養，而后轉接于BMGY培養基，于30℃、220rpm培養該工程菌16-18h，至OD₆₀₀＝2.0-6.0；室溫下1500g離心5min，收集菌體；再用10mL的BMMY培養基重懸菌體，使OD₆₀₀＝1.0左右，將所得的菌液置于100mL無菌三角瓶中，于28℃、220rpm下繼續振蕩培養；每24小時向培養基中添加甲醇至終濃度為1％進行誘導培養；

6)發酵結束后，取發酵液離心除去酵母細胞，得發酵上清；在非變性條件下，用Ni-NTAHis Bands樹脂吸附重組膠原，用洗滌液洗去雜質，最后再洗脫重組膠原，收集洗脫液；洗脫液經超濾系統脫鹽、濃縮；再將濃縮液用Strep-Tactin樹脂吸附重組膠原，用洗滌液洗去雜質，最后再洗脫重組膠原，收集洗脫液；洗脫液經超濾系統脫鹽、濃縮，所制得的濃縮液經真空冷凍干燥制得所述重組人源I型膠原α1鏈蛋白。