[發(fā)明專利]一種L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體及其應用

有效

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• 申請日: 2019-11-18
• 公開（公告）號: CN110804602B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設計）人: 周哲敏;劉中美;于佳印;趙庭;周麗;崔文璟;郭軍玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一種L?天冬氨酸β?脫羧酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明提供的L?天冬氨酸β?脫羧酶突變體N35D、A179E，pH 7.0條件下催化酶活性分別提高238％、244％。pH 4.5條件下處理12h酶活分別剩余83.9％、85.5％，相比對照野生型酶殘余酶活24.8％，突變體酸穩(wěn)定性有明顯提高。因此，本發(fā)明提供的L?天冬氨酸β?脫羧酶突變體N35D、A179E具有較好的酶學性質。

技術領域

本發(fā)明涉及一種L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

L-丙氨酸是一種具有重要價值的氨基酸，在日化、食品和醫(yī)藥行業(yè)中有著廣泛的用途。在日化領域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性劑的原料；在食品領域，L-丙氨酸具有甜味，能與谷氨酸鈉制成混合調味品，可調制并明顯改善食品風味，而不破壞食品原有的風味；在醫(yī)藥領域，L-丙氨酸是合成維生素B6和L-氨基丙醇(鹽酸左氧氟沙星合成前體)的主要原料；同時，L-丙氨酸是復合氨基酸注射液和輸液的主要成分，也是心肌功能增強劑。

在化學合成生產中，丙酸氯化法是合成L-丙氨酸的常見思路，但該方法存在產品質量差、合成路線長、收率低、成本高、環(huán)境污染嚴重等缺點，目前基本被淘汰。使用生物酶催化法和發(fā)酵法制備L-丙氨酸已成為工業(yè)生產上主要采用的方法。

目前用于制備L-丙氨酸的生物合成法主要有兩種，一種是優(yōu)化代謝途徑，敲除次級代謝產物編碼基因和L-丙氨酸消耗旁路基因，獲得生產L-丙氨酸菌株，在培養(yǎng)微生物過程中合成L-丙氨酸；周麗等以野生型大腸桿菌為出發(fā)菌株，敲除代謝產物合成途徑編碼基因以及丙氨酸消旋酶編碼基因，將L-丙氨酸脫氫酶基因轉入缺陷型菌株中獲得目的菌株，該菌株發(fā)酵生產L-丙氨酸在搖瓶水平產量可達67.2g/L(引用文獻：周麗，鄧璨，崔文暻，劉中美，周哲敏.溫度調節(jié)基因開關調控大腸桿菌發(fā)酵合成L丙氨酸[J].微生物學通報,2015,42(11):10.)。另一種方法是生物酶法，即通過表達L-天冬氨酸β-脫羧酶，以L-天冬氨酸作為底物，脫去β-羧基生成L-丙氨酸。編碼L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因Asd被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于假分枝桿菌、假單胞菌、糞產堿菌、醋酸桿菌、產氣莢膜菌等微生物中。目前發(fā)現(xiàn)的L-天冬氨酸β-脫羧酶大多具有較差的酸穩(wěn)定性，在中性條件(pH 7.0)下催化活性較低。徐虹等人通過誘變獲得一株具有L-天冬氨酸β-脫羧酶活性的假單胞菌，對底物L-天冬氨酸催化轉化率接近100％，但需要5天進行催化反應，時間過長(引用文獻：徐虹,王雪根,劉濟瑞,等.利用假單胞菌天冬氨酸_脫羧酶高效生產L_丙氨酸[J].南京化工學院學報,1995,17(1).)；Wang等人在大腸桿菌異源表達Pseudomonas sp.ATCC 19121來源的Asd酶，該酶比酶活為280U/mg，比酶活較低(引用文獻：Wang N-C,Lee C-Y.Molecular cloning of the aspartate 4-decarboxylase gene from Pseudomonas sp.ATCC 19121 and characterization of thebifunctional recombinant enzyme[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,73(2):339-348.)。

因此，提供一種高產L-丙氨酸的方法、一種酶活更高、酸穩(wěn)定性更高的L-天冬氨酸β-脫羧酶，對于工業(yè)應用生產L-丙氨酸具有重要的意義。

發(fā)明內容

為了解決這些問題，本發(fā)明通過對編碼抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)來源的L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因進行突變，構建得到兩個酸穩(wěn)定性提高的突變體N35D、A179E。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種L-天冬氨酸β-脫羧酶突變體，所述L-天冬氨酸β-脫羧酶含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。